EMA发布亚硝胺杂质问答附录3，列出N-亚硝胺增强Ames试验条件

EMA 亚硝胺技术文件：附录 3：N-亚硝胺的增强 Ames 试验条件

官方目录首次发布：2023-11-09。本次目录更新：2024-03-26。

目录文件编号：EMA/120337/2024。

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2024年3月26日
EMA/120337/2024
欧洲药品管理局




关于人用药品中亚硝胺杂质
依据 Regulation (EC) No 726/2004 第 5(3) 条转介的 CHMP 意见
上市许可持有人/申请人的问答
附录 3

N-亚硝胺的增强 Ames 试验条件




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经济合作与发展组织（OECD）第471号测试指南
“细菌回复突变试验”为开展细菌回复突变试验（亦称Ames试验）以评估受试化合物的致突变潜力提供了标准建议。对于N-亚硝胺，由于有报道称某些N-亚硝胺（如N-亚硝基二甲胺（NDMA））在标准条件下该试验的灵敏度降低，因此建议采用增强的Ames试验条件。此外，对于N-亚硝胺原料药相关杂质（NDSRIs），人们对其Ames试验的灵敏度知之甚少，NDSRIs是最近被确认的一类与原料药结构相关的N-亚硝胺杂质。与历史上研究过的低分子量N-亚硝胺（如NDMA）相比，NDSRIs通常具有更多种类的官能团。

如果进行了标准Ames试验并产生阳性结果，则无需使用增强试验条件进行额外试验。

下文介绍的增强Ames试验条件参考了FDA国家毒理学研究中心（NCTR）开展的工作（Li等，2023）以及其他团队的工作，并已针对包括NDSRIs在内的多种N-亚硝胺进行了评估。针对N-亚硝胺的Ames试验条件的评估仍在进行中，目标是确定最稳健的Ames试验条件。下文所述的增强Ames试验条件将在必要时更新。偏离推荐条件应有正当理由。

测试菌株：应包括鼠伤寒沙门氏菌TA98、TA100、TA1535、TA1537和大肠杆菌WP2 uvrA（pKM101）测试菌株。

试验类型和预孵育时间：应使用预孵育法，而非平板掺入法。推荐的预孵育时间为30分钟。

S9的来源物种和浓度：Ames试验应在无线粒体后组分（S9）的情况下进行，也应在含30%大鼠肝S9以及30%仓鼠肝S9的情况下进行。大鼠和仓鼠线粒体后组分（S9）应制备自经细胞色素P450酶诱导剂（例如苯巴比妥和β-萘黄酮的组合）处理的啮齿动物。

阴性（溶剂/溶媒）对照：根据OECD 471指南，溶剂需与Ames试验兼容。溶剂可包括但不限于：

水
有机溶剂，如丙酮、甲醇和DMSO


当使用有机溶剂时，应在预孵育混合物中加入尽可能低的体积，并提供正当理由以表明该溶剂体积不会干扰N-亚硝胺的代谢活化。

阳性对照：根据OECD 471指南，应包含同步的菌株特异性阳性对照。

还应包含两种已知在S9存在下具有致突变性的N-亚硝胺作为阳性对照。

N-亚硝胺阳性对照品的选择需要基于对N-亚硝胺预期代谢途径以及最可能参与的细胞色素P450酶进行论证。此外，如果使用有机溶剂溶解供试化合物，建议用于溶解N-亚硝胺阳性对照品的有机溶剂体积，应使阳性对照品在预孵育混合液中的浓度与供试化合物相近。


关于人用药品中亚硝胺杂质的Regulation (EC) No 726/2004第5(3)条转介CHMP意见的上市许可持有人/申请人问答附录3
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可考虑的 N-亚硝胺阳性对照包括：

1. NDMA（CAS 号 62-75-9）
2. 1-环戊基-4-亚硝基哌嗪（CAS 号 61379-66-6）
3. 一种 NDSRI
Ames 试验的所有其他建议应遵循 OECD 471 指南。


增强型 Ames 试验（EAT）所需信息的检查清单如下所示，
可用于在 EAT 报告中提供所用条件和所得结果的摘要。


受试物：

申办者：
试验机构：

GLP 符合性：是/否
研究启动日期：

实验开始日期：
实验完成日期：


EAT 要求 EAT 中使用的条件 备注
菌株：（例如鼠伤寒沙门氏菌 TA98、TA100、
TA1535、TA1537 和大肠杆菌 WP2 uvrA（pKM101））
预孵育法，30 分钟
大鼠（30%）
S9
仓鼠（30%）
所用溶剂及体积1（µL）（a）
预孵育混合液体积（µL）（b）
预孵育中溶剂浓度（% v/v）1
受试浓度（µg/皿）
亚硝胺阳性对照 1（µg/皿），包括
溶剂浓度（% v/v）2, 3
NDSRI 阳性对照 2（µg/皿），包括
溶剂浓度（% v/v）2, 3
非亚硝胺阳性对照2,4
阴性对照2
结果（阳性/阴性）
1
当使用有机溶剂时，应在预孵育混合液中加入尽可能低的体积，
并提供理由以表明溶剂体积不干扰 N-亚硝胺的代谢活化。有机溶剂浓度（% v/v）应按预孵育混合液中含受试物的所加溶剂体积除以预孵育混合液总体积计算，即
（a/b）*100，例如若受试物加在 100 µL 有机溶剂中，预孵育混合液总体积
为 700 µL，则溶剂浓度为 14.3%（v/v）
2
同步对照
3
受试物和阳性对照所用溶剂最好相同，若不同则应提供理由。
4
阳性对照参考物质，例如 OECD 471 对采用代谢活化系统的试验所建议的物质。

参考文献：
OECD 试验指南第 471 号“细菌回复突变试验”。2020

Li 等。重新审视 N-亚硝基普萘洛尔在细菌和
人体体外试验中的致突变性和遗传毒性。Regulatory Pharmacology and Toxicology。2023




附录3：关于人用药品中亚硝胺杂质的 Regulation (EC) No 726/2004 第5(3)条转介的 CHMP 意见，上市许可持有人/申请人的问答
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