多肽类样品HPLC含量检测方法学验证方案（依据ICH-Q2(R1)及《中国药典》2025年版四部通则9101）

1 目的

本方案对多肽类样品反相高效液相色谱含量检测方法开展全套方法学验证。证明该检测方法适用于多肽各工艺中间体及原液的含量测定，确保检测结果准确、可靠、重现，满足药典及GMP要求。

2 范围

2.1 本验证适用于多肽各工艺中间体、多肽原液的HPLC含量测定方法。

2.2 各工艺中间体与原液使用同一检测方法，仅缓冲基质存在差异；工艺中间体仅做系统适用性、专属性；原液完成全部验证项目。

3 职责

3.1 QC部门

1）负责验证方案、验证报告的起草、内部审核；

2）负责验证实施前对参与人员开展方案培训；

3）负责验证试验实施、原始数据记录、数据汇总整理；

4）负责试验过程偏差、变更的记录、初步调查及处理。

3.2 QA部门

1）负责验证方案、验证报告的审核；

2）确认参与验证人员已完成培训，检查培训相关记录；

3）监督验证实施过程，复核验证汇总数据；

4）参与偏差、变更的调查处理；

5）负责验证方案、报告及全部附件记录归档。

3.3 质量负责人

1）负责验证方案、验证报告最终批准；

2）负责重大偏差、变更的批准。

4 参考法规及指南

4.1USP‑NF<1225>Validation of Compendial Procedures

4.2 ICH‑Q2(R1) 分析方法验证

4.3 《中国药典》2025年版四部 通则9101 分析方法验证指导原则

4.4 《中国药典》2025年版四部 通则0512 高效液相色谱法

5 缩写与定义

5.1 缩写

1. HPLC：High‑Performance Liquid Chromatography，高效液相色谱，依靠高压输液系统将流动相输送至色谱柱，实现样品组分分离与定量检测的分析仪器。

2. RSD：Relative Standard Deviation，相对标准偏差，也称变异系数；用于表征多组检测数据离散程度，为标准偏差与算术平均值的比值，以百分比表示，评价分析方法精密度。

3. DAD：Diode Array Detector，二极管阵列检测器；高效液相色谱常用检测器，可以同时采集多个波长下样品色谱信号，可用于峰纯度辅助考察。

5.2 术语定义

1. 专属性：指在存在潜在干扰物质（缓冲基质、工艺相关组分等）条件下，分析方法能够准确测定目标被测物的能力。

2. 线性与范围：指在一定浓度区间内，被测物浓度与仪器响应信号呈成比例关系；该浓度范围即为方法适用范围。

3. 准确度：分析方法测定结果与样品真实值接近的程度，含量测定一般采用加标回收试验进行评价，以回收率表示。

4. 重复性：同一操作人员、同一台仪器、短时间内，对同一样品多次独立制备测定，考察检测结果的一致性，反映方法的室内精密度。

5. 中间精密度：在同一实验室内，不同操作人员、不同试验日期（可更换仪器）条件下，同一样品多次测定结果的一致程度，用于评估实验室内部正常条件波动带来的检测变异。

6. 耐用性：指分析方法面对检测条件发生微小、合理波动时，依旧可以保持检测结果可靠的能力；用于识别方法敏感参数，为检验SOP设定参数控制限度。

7. 系统适用性：HPLC色谱系统综合性能评价，通过考察保留时间、拖尾因子、峰面积RSD等指标，确认色谱系统满足本次样品检测要求，系统适用性不合格不得开展样品检测。

8. 供试品溶液稳定性：考察配制完成的供试品溶液，在样品盘规定储存温度下放置不同时长，被测组分含量是否保持稳定，用于确定样品上机放置最长时限。

6 风险评估

6.1 风险管理流程

执行质量风险管理流程：风险辨识→风险分析→风险评价→风险控制（风险降低/接受风险）→风险评审。风险优先数 RPN = 严重性(S) × 可能性(O) × 可检测性(D)。

6.2 风险辨识、分析、评价与控制措施

6.3 风险接受结论

落实上述控制措施后，所有风险降低至可接受水平。

7 实施前置条件确认

7.1 人员培训确认

目的：确认所有参与验证人员已经完成方案培训，熟悉分工、试验内容和时间计划。

方法：采用现场授课或自学方式开展方案培训。

可接受标准：全部参与人员完成培训，知晓本人分工、试验内容。

试验记录：附件1《人员培训确认记录》。

7.2 仪器仪表校验确认

目的：确认试验所用仪器、计量器具校验合格，在校有效期。

方法：核查高效液相色谱仪、电子天平、超纯水机、pH多参数测试仪、各规格移液器的校验证书及校验记录。

可接受标准：全部仪器仪表校验合格，处于有效期。

试验记录：附件2《仪器仪表校验确认记录》。

7.3 文件资料确认

目的：确认验证相关SOP、本验证方案为现行有效批准版本。

方法：核对文件编号、版本号、生效日期。

可接受标准：所有使用文件为现行已批准生效版本。

试验记录：附件3《文件资料确认记录》。

7.4 试剂、对照品确认

目的：确认试验所用试剂、多肽对照品在有效期。

方法：核对试剂、对照品标签有效期信息。

可接受标准：试剂、对照品均在有效期内。

试验记录：附件4《试剂、对照品确认记录》。

8 检测方法描述

说明：样品目标检测浓度：250 μg/mL。

8.1 仪器设备

高效液相色谱仪，配备DAD二极管阵列检测器；分析天平；超纯水机；pH测试仪；移液器。

8.2 色谱条件

- 色谱柱：C18（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）或等效色谱柱

- 柱温：40 ℃±5 ℃

- 样品盘温度：5 ℃

- 流速：1.0 mL/min

- 检测波长：214 nm

- 进样体积：20 μL

- 采集时间：15 min

- 洗脱方式：等度洗脱

- 主峰保留时间：7.5 min‑11.7 min；可适当调整流动相比例，保证主峰落在该区间。

8.3 试剂、溶液配制

8.3.1 0.2 mol/L硫酸盐缓冲液

称取无水硫酸钠，加水溶解，磷酸调节pH至2.3，使用0.2 μm水系滤膜过滤。

8.3.2 流动相A、流动相B

流动相A：乙腈‑0.2 mol/L硫酸盐缓冲液=10:90，混匀超声脱气；盐析出可温和加热搅拌。

流动相B：乙腈‑0.2 mol/L硫酸盐缓冲液=50:50，混匀超声脱气；盐析出可温和加热搅拌。

工作流动相：流动相A∶流动相B =63∶37；可预先单通道混合，也可仪器双通道在线混合。

8.3.3 空白溶液（样品稀释液）

乙腈‑0.2 mol/L硫酸盐缓冲液按对应比例配制，超声脱气备用。

8.3.4 对照品母液

精密称取多肽对照品适量，使用空白稀释液溶解并定容，配制成浓度约 1000 μg/mL对照品母液。

8.3.5 对照品工作溶液

取对照品母液，空白稀释液稀释，配制成250 μg/mL目标浓度对照品工作溶液，平行制备3份。

8.3.6 供试品溶液

多肽原液：取原液适量，空白稀释液稀释至250 μg/mL；

工艺中间体：低浓度中间体不稀释直接进样；高浓度中间体用空白稀释液稀释。

浓度预估：可以采用A280分光法预估样品浓度，消光系数用于浓度快速估算。

8.4 进样序列

空白溶液进样1针；对照品溶液每份进样1针；供试品溶液每份进样2针。

8.5 计算方法

采用外标法；对照取多份对照品平均峰面积计算供试品含量。

8.6 系统适用性要求

1）空白溶液：主峰出峰位置无干扰峰；

2）对照品主峰拖尾因子≤1.5；

3）对照品峰面积RSD ≤1.25%；

4）主峰保留时间7.5‑11.7 min。

9 验证实施项目

9.1 系统适用性

目的：确认整套色谱系统满足检测要求，系统不合格不得进行样品检测。

试验方法

1）色谱条件：执行8.2项下色谱条件；

2）溶液制备：空白溶液1份；对照品工作溶液（250 μg/mL）平行制备3份；

3）测定步骤：待基线平稳，空白溶液进样1针；3份对照品溶液分别进样1针，采集色谱图。

可接受标准

1）空白溶液在主峰位置无干扰峰；

2）主峰保留时间7.5 min‑11.7 min；

3）主峰拖尾因子≤1.5；

4）3份对照品主峰峰面积RSD ≤1.25%。

试验记录：附件5《系统适用性确认记录》

9.2 专属性

目的：考察空白溶剂、各工艺缓冲基质是否对多肽主峰产生干扰；工艺中间体、原液均需考察。

中间体只需要做系统适用性+专属性；原液全套验证。

试验方法

1）色谱条件：执行8.2项下色谱条件；

2）溶液制备：空白溶液、对照品工作溶液（250 μg/mL）；各工艺步骤对应的缓冲基质溶液；全部工艺中间体、原液供试品。

3）全部溶液依次进样。

可接受标准

1）空白、各工艺缓冲基质，在多肽主峰位置无干扰峰；

2）系统适用性参数满足要求；

3）各供试品可正确检出，含量落在各自质量标准区间。

试验记录：附件6《专属性确认记录》

9.3 重复性（精密度‑同一人员、同一仪器、同一天）

目的：考察同一条件下原液检测结果重现性。

试验方法

1）色谱条件：执行8.2项下色谱条件；

2）溶液：空白、3份对照品工作溶液（250 μg/mL）；平行制备6份原液供试品溶液，浓度调整至250 μg/mL；

3）依次进样，计算6份含量。

可接受标准

6份供试品含量RSD ≤3.0%（n=6），系统适用性符合要求,并报告SD，RSD和95%的置信区间。

试验记录：附件7《重复性确认记录》

9.4 中间精密度（不同人员、不同日期）

目的：考察实验室不同人员不同时间检测结果重现。

试验方法

1）色谱条件：执行8.2项下色谱条件；

2）更换操作人员，更换试验日期；平行制备6份原液供试品溶液，浓度调整至250 μg/mL；

3）进样测定；合并重复性+中间精密度一共12份结果统计。

可接受标准

单独6份RSD≤3.0%；12份合并RSD ≤6.0%，并报告SD，RSD和95%的置信区间。

试验记录：附件8《中间精密度确认记录》

9.5 线性与范围

目的：确认浓度‑峰面积响应线性关系，覆盖样品检测浓度区间。

试验方法

1）色谱条件：执行8.2项下色谱条件；

2）配制系列线性溶液，以250 μg/mL作为100%点：

‑ 60%：150 μg/mL

‑ 80%：200 μg/mL

‑ 100%：250 μg/mL

‑ 120%：300 μg/mL

‑ 140%：350 μg/mL

共5个浓度点；每个浓度进样3针。

3）以浓度为X，峰面积Y做最小二乘法回归。

可接受标准：相关系数 R ≥0.995。

试验记录：附件9《线性与范围确认记录》

9.6 准确度（加标回收法）

目的：评估方法测定结果与真实值的偏差。

试验方法

1）色谱条件：执行8.2项下色谱条件。

2）溶液配制（明确浓度、体积配比）

① 空白稀释液：同8.3.3项下空白溶液；

② 多肽对照品母液：精密称取多肽对照品，用空白稀释液溶解定容，配制成1000 μg/mL母液；

③ 加标对照工作液配制：

‑ 低浓度（80%）：200 μg/mL

‑ 中浓度（100%）：250 μg/mL

‑ 高浓度（120%）：300 μg/mL

④ 原液本底供试品：原液预先稀释，本底浓度控制≈250 μg/mL。

⑤ 加标供试品制备（等体积混合法，V本底:V加标工作液 =1:1）

‑ 低浓度加标组（理论加标水平80%）：取100 μL本底供试品 + 100 μL 200 μg/mL加标对照工作液，混匀，平行制备3份；

‑ 中浓度加标组（理论加标水平100%）：取100 μL本底供试品 + 100 μL 250 μg/mL加标对照工作液混匀，平行制备3份；

‑ 高浓度加标组（理论加标水平120%）：取100 μL本底供试品 + 100 μL 300 μg/mL加标对照工作液混匀，平行制备3份；

合计低、中、高每个浓度3份，共9份加标样品；同时保留未加标的原液本底供试品，用于本底含量扣除计算回收率。

3）测定步骤：基线稳定，空白、对照品工作溶液、未加标本底供试品、9份加标样品依次进样；记录色谱图。

4）计算：先计算未加标样品本底含量；再计算加标样品总测得含量；扣除本底，计算加标部分实测值，计算回收率。

回收率% =（加标样品测得总含量 − 样品本底含量）÷理论加入对照品含量 × 100%

可接受标准

1）系统适用性各项指标符合要求；

2)低、中、高浓度回收率 90.0%‑108.0%；

3)9份加标样品回收率RSD ≤4.0%（n=9）。

4)并报告回收率95%的置信区间。

试验记录：附件10《准确度确认记录》

9.7 溶液稳定性

目的：确认供试品配制后，样品盘5℃放置条件下稳定时间。

试验方法

1）色谱条件：执行8.2项下色谱条件；

2）配制供试品溶液、对照品工作溶液、空白溶液；原液供试品溶液稀释至250 μg/mL；

3）全部溶液放置于5℃样品盘；分别在0 h、24 h、48 h、72 h时间点进样测定；记录色谱图，计算各个时间点样品含量。

可接受标准

1）各时间点系统适用性满足要求；

2）各个时间点与0h对比，含量RSD ≤3.0%。

试验记录：附件11《溶液稳定性确认记录》

9.8 耐用性

目的：评估色谱关键参数发生微小合理波动时，对检测结果、色谱行为的影响；模拟日常检验中仪器、流动相配制带来的微小偏差，确认方法具备足够抗干扰能力。

考察参数包含：柱温、流速、检测波长、流动相比例、流动相pH；

每项参数独立变更，其余条件保持原始标准色谱条件不变，每一项变动参数均需要完整做系统适用性+样品测定。

试验方法

1）标准参考色谱条件：执行8.2项下原始色谱条件，作为对照。

2）各项参数变动范围（仅做微小偏离，不超出实验室日常操作允许波动）：

变动范围如下:

色谱柱柱温 40 ℃、 35 ℃、45 ℃（±5℃）

流速 1.0 mL/min、 0.8 mL/min、1.2 mL/min（±0.2 mL/min）

检测波长 214 nm、 210 nm、218 nm（±4 nm）

流动相比例（A:B） 63:37、 61:39、65:35（±2%比例）

流动相pH 2.3、 2.2、2.4（±0.1pH单位）

3）溶液制备：空白溶液；对照品工作溶液250 μg/mL；原液供试品溶液250 μg/mL。

4）测定操作：

① 每一组变动条件下，先进空白、再进3针对照品工作溶液，完成系统适用性考察；

② 系统适用性合格后，进样2针对液供试品溶液；

③ 记录色谱图，统计：保留时间、拖尾因子、峰面积、样品测定含量；

④ 将各变动条件下结果，与原始标准色谱条件的结果进行对比。

可接受标准

1）所有变动条件下，系统适用性全部满足本方案8.6的系统适用性要求：空白无干扰；拖尾因子≤1.5；对照峰面积RSD ≤1.25%；主峰保留时间7.5‑11.7 min；

2）耐用性各条件下供试品测得含量，与标准条件测得含量比较，相对偏差在±5.0%以内；

3）主峰与相邻潜在杂质峰无共流出，无干扰；

4）若某一参数发生上述范围波动，结果不满足可接受标准，则在SOP中对该色谱参数做严格限定，明确该参数的控制范围。

试验记录：附件12《耐用性确认记录》

重要说明：耐用性试验不是考察极端失效条件；如果参数超出本方案的波动范围，则本方法不再适用。

10 结果综合判定

10.1 全部前置条件确认项目合格。

10.2 系统适用性、专属性、重复性、中间精密度、线性范围、准确度、供试品溶液稳定性、耐用性全部项目满足可接受标准，判定本方法验证通过。

10.3 若任意项目不满足可接受标准，需开展调查，采取纠正措施后重新开展对应试验；耐用性如部分参数不满足，需要在检验SOP中明确该参数严格控制限度。

11 偏差处理

11.1 验证实施过程，任何偏离本方案的情况，必须启动GMP偏差处理流程。

11.2 开展偏差调查，评估偏差对验证数据、验证结论的影响。

11.3 根据调查结论，采取纠正措施，必要时重做部分或全部验证试验。

11.4 所有偏差处理记录纳入验证归档资料。

12 变更控制

12.1 检测方法、色谱柱、仪器、试剂体系发生变更，需要开展变更评估。

12.2 根据评估结果，决定是部分再验证，还是全套重新开展方法学验证。

12.3 变更相关记录纳入验证归档资料。

13 验证报告输出要求

验证报告需要包含：验证目的、范围、职责、法规依据、风险评估总结、前置确认汇总、每一项验证试验结果汇总、耐用性各参数对比汇总、偏差变更汇总、综合验证结论。报告经QC、QA审核，质量负责人批准后归档。

13、附件清单

附件1：人员培训确认记录

附件2：仪器仪表校验确认记录

附件3：文件资料确认记录

附件4：试剂、对照品确认记录

附件5：系统适用性确认记录

附件6：专属性确认记录

附件7：重复性确认记录

附件8：中间精密度确认记录

附件9：线性与范围确认记录

附件10：准确度确认记录

附件11：供试品溶液稳定性确认记录

附件12：耐用性确认记录