微生物限度平皿倾注法方法适用性验证方案及回收比值判定标准

1 目的

本方案开展平皿法（倾注法）微生物计数方法适用性验证，确认平皿倾注法适用于本供试品的需氧菌总数、霉菌酵母菌总数计数；消除供试品抑菌物质对检测结果的干扰，保证微生物限度检测结果真实准确，满足《中国药典》通则1105以及USP‑NF<61>要求。

2 范围

本方案适用于企业中间产品/制剂样品，平皿倾注法的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数方法适用性试验。

本验证仅覆盖规定供试品；若供试品配方、工艺、稀释方式、检验SOP发生变更，需要重新开展方法适用性验证。

⚠️说明：平皿法适合抑菌活性弱的样品；如果样品抑菌作用强，优先选择薄膜过滤法。

3 职责

3.1 QC部

1）负责验证方案、验证报告起草、内部审核；

2）验证实施前操作人员方案、SOP培训；

3）负责现场试验、原始数据记录、数据汇总；

4）记录偏差异常，配合偏差调查处理；

5）完成全部试验记录、附件填写。

3.2 QA部

1）审核验证方案与验证报告；

2）确认人员培训完成，核查培训记录；

3）全程监督验证实施，复核汇总试验数据；

4）参与偏差、变更评估，提供质量支持；

5）全套方案、报告、附件归档管理。

3.3 质量负责人

1）方案、验证报告最终审核批准；

2）审批验证重大偏差、相关变更。

4 参考法规指南

1）USP‑NF <61> Microbiological Examination of Nonsterile Products‑Microbial Enumeration Tests

2）《中华人民共和国药典》四部 通则1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法

3）药典9202非无菌药品微生物限度检查指导原则

5 验证对象

5.1 供试品

待验证供试品，采用平皿倾注法开展计数适用性，独立开展3次平行验证试验。

5.2 试验标准菌株

1.金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus ATCC 6538（革兰阳性细菌）

2.铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027（革兰阴性细菌）

3.枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis ATCC 6633（产芽孢细菌）

4.白色念珠菌 Candida albicans ATCC 10231（酵母菌）

5.巴西曲霉 Aspergillus brasiliensis ATCC 16404（霉菌）

菌悬液要求：每0.1mL菌液含菌量 10cfu～100cfu，现配现用，同时满足ChP、USP<61>要求。

5.3 试验原理

制备适宜稀释度供试液，取供试液置于无菌平皿，加入标准试验菌悬液，再倾注温度≤45℃熔化培养基，混匀凝固后倒置培养。

设置4个组别：试验组、菌液对照组、供试品对照组、阴性对照组。

对比各组菌落计数，计算菌株回收率（回收比值），判断平皿法是否适合本样品检测。

✅平皿法关键点：菌是直接加到平皿内，和供试液混匀，再倒培养基；不是加到稀释缓冲液中。

🔴QC高频易错提醒

1. 平皿倾注法：菌悬液加在平皿里面，不要加到稀释瓶、缓冲液瓶！

2. 薄膜过滤法：试验菌要加入最后一次冲洗液一起过滤，不要随供试液一起过滤！

3. 两种方法计算公式完全一样，差异核心在于「加菌位置」与「抑菌物质去除手段」。

6 实施前提条件（确认全部合格再启动试验）

6.1 人员培训确认

参与验证人员完成方案、SOP培训；掌握平皿倾注操作、菌悬液制备。记录填写附件：人员培训确认记录。

6.2 仪器设备校验确认

生物安全柜、生化培养箱、天平、移液枪等全部在校验有效期；核查校验证书，填写仪器校验确认记录。

6.3 文件确认

验证方案、微生物限度SOP为受控生效现行版本。

6.4 实验材料器材确认

1）供试品；

2）标准工作菌株；

3）培养基：胰酪大豆胨琼脂（TSA）、沙氏葡萄糖琼脂（SDA），培养基已经完成培养基适用性检查；

4）稀释液：pH7.0无菌氯化钠‑蛋白胨缓冲液；巴西曲霉悬液制备用添加0.05%聚山梨酯80的缓冲液；

5）耗材：90mm无菌平皿、无菌移液管、枪头，确认灭菌合格，在有效期。

6.5 菌悬液制备

1）传代菌株：按照药典复苏传代，缓冲液梯度稀释，制备每0.1mL含10‑100cfu菌悬液，现配现用。

2）冻干ATCC菌株：复水，水化，梯度稀释，涂布计数确认菌浓度。

7 试验实施内容

每组菌株每个组别，平行制备2个平皿；整套试验重复3次独立平行试验。

⚠️平皿法：菌悬液直接加至平皿内，再加入供试液，随后倾注培养基，充分混匀。

7.1 试验组（样品+菌）

1）取90mm无菌平皿，先加入0.1mL试验菌悬液（10‑100cfu）；

2）再加入1mL适宜稀释度供试液；

3）立即倾注15‑20mL温度不超过45℃熔化的对应琼脂培养基，轻轻转动平皿充分混匀，静置等待凝固；

4）倒置培养：

- 细菌（金葡、铜绿、枯草芽孢杆菌）TSA培养基：30‑35℃培养3‑5天

- 白色念珠菌、巴西曲霉 SDA培养基：20‑25℃培养5‑7天

5）培养结束，计数平板菌落。

7.2 菌液对照组（只有菌，无供试品）

1）无菌平皿，加入0.1mL相同试验菌悬液；

2）加入1mL空白稀释缓冲液，不加供试品；

3）倾注对应培养基，混匀凝固，同上条件培养，每个菌株2个平皿。

意义：无样品干扰条件，得到该批次菌悬液真实菌落水平。

7.3 供试品对照组（样品，不加试验菌）

1）平皿内加入1mL供试液；不加菌悬液；

2）倾注对应培养基，混匀凝固；

3）同样培养条件培养计数，平行2皿。

意义：测定供试品本底自带菌落数，用于计算回收率时扣除本底。

7.4 阴性对照组

平皿加入1mL无菌pH7.0氯化钠‑蛋白胨缓冲液，倾注培养基，不加样品不加菌；培养后计数。

意义：确认耗材、培养基、操作环境无外源微生物污染。

7.5 结果计算公式

回收比值=（试验组平均菌落数‑供试品对照组平均菌落数)/（菌液对照组平均菌落数)

全部菌落计数填写附件《方法适用性试验记录》。

7.6 试验有效性与判定标准

1）试验有效前提：阴性对照组平板无菌落生长；阴性对照长菌落，本次试验直接无效，调查污染来源，全部重做。

2）可接受标准：每种试验菌回收比值0.5～2.0，3次独立平行试验均满足0.5‑2.0，判定平皿倾注法适用于本供试品，后续样品可直接采用平皿法开展微生物限度检测。

3）若任意菌株回收比值不在0.5‑2.0：说明当前稀释条件下样品仍存在抑菌作用，需要提高稀释级别、更换中和方式；若平皿法无法消除抑菌，则改用薄膜过滤法。

4）供试品对照组检出菌落，结果应当符合该供试品质量标准限度。

8 偏差处理

验证全过程出现任何偏离本方案、SOP的情况，执行企业《偏差处理规程》，开展调查，评估对结果的影响，采取纠正预防措施；重大偏差需要质量负责人批准，必要时重新开展验证。

9 变更控制

供试品配方、工艺、稀释方法、检验条件发生变更；需要评估是否重新开展平皿法适用性验证，按照企业变更管理规程执行。

10 验证周期

1）发生以下情况，需要重新开展本方法适用性验证：

- 检验方法发生改变；

- 供试品生产工艺重大变更；

- 配方原料发生重大变更。

2）常规无变更情况下，不需要重复验证。