工艺中间产品微生物限度方法适用性验证方案（薄膜过滤法）

1 目的

本方案通过对影响微生物限度检测结果的各关键因素开展方法适用性验证，确认所采用的薄膜过滤法适用于本供试品的微生物限度检查；消除供试品潜在抑菌活性带来的检测干扰，保证微生物限度检测结果真实、准确，符合《中国药典》要求以及 USP‑NF〈61〉《非无菌产品微生物检查：微生物计数试验》相关要求。

2 范围

本方案适用于本企业该中间产品的微生物限度方法适用性验证。仅针对薄膜过滤法需氧菌总数计数方法适用性试验。本验证仅覆盖试验规定供试品，如供试品配方、工艺、检测方法发生变更，需重新开展方法适用性验证。

3 职责

3.1 QC 部

1）负责本验证方案、验证报告的起草、内部审核；

2）负责验证实施前相关人员方案、操作规程的培训；

3）负责方案现场实施，原始试验数据记录、数据汇总整理；

4）对验证过程中出现的偏差、异常进行记录，配合开展调查与处理；

5）按要求完成各项确认记录及试验记录填写。

3.2 QA 部

1）负责验证方案、验证报告的审核；

2）确认参与验证人员完成培训，核查培训记录；

3）参与、监督验证全过程实施，复核验证数据汇总结果；

4）参与偏差、变更的调查评估，提供质量支持；

5）负责验证方案、验证报告及全套附件记录的归档管理。

3.3 质量负责人

1）负责本验证方案、验证报告的最终审核与批准；2）负责验证过程重大偏差、相关变更的批准。

4 参考法规与指南

1）USP‑NF 〈61〉 Microbiological Examination of Nonsterile Products‑Microbial Enumeration Tests

2）《中华人民共和国药典》四部 通则 1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法

5 验证对象描述

5.1 供试品

供试品为工艺中间产品，本次验证采用薄膜过滤法进行需氧菌总数计数方法适用性试验，开展3 次独立平行验证试验。

5.2 试验标准菌株

选择具有代表性的标准菌株，覆盖革兰阳性细菌、革兰阴性细菌、产芽孢细菌、酵母菌、霉菌：

1. 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus ATCC 6538（革兰阳性菌）

2. 铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027（革兰阴性菌）

3. 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis ATCC 6633（芽孢杆菌）

4. 白色念珠菌 Candida albicans ATCC 10231（酵母菌）

5. 巴西曲霉 Aspergillus brasiliensis ATCC 16404（霉菌）

说明：菌株选择需同时满足《中华人民共和国药典》以及 USP〈61〉相关要求。

5.3 试验原理

取定量供试品通过微孔滤膜过滤，选用适宜缓冲液对滤膜进行冲洗，去除供试品抑菌物质；滤膜贴附于相应培养基表面，在规定温度、时间条件下培养；通过对比试验组、菌液对照组、供试品对照组、阴性对照组菌落计数结果，计算各试验菌株回收比值，判定检测方法是否适用。

6 实施前提条件

验证开始前，下述全部前提条件确认合格后方可启动试验，所有确认结果形成书面记录。

6.1 人员培训确认

1）参与验证人员：XXX、XXX、XXX

2）目的：确保全部参与人员完成方案、相关 SOP 培训，清楚验证时间、试验内容、岗位职责。

3）培训方式：现场授课、文件自学相结合。

4）可接受标准：所有参与人员完成培训，掌握方案要求与岗位工作内容。

5）记录：填写附件 1《人员培训确认记录》。

6.2 仪器设备校验确认

1）目的：确认试验所用仪器全部完成校验且在有效期。

2）涉及主要设备：高压灭菌锅、生物安全柜、生化培养箱、微生物限度过滤系统、电子天平、移液枪等。3）方法：查阅仪器校验证书 / 校验记录。

4）可接受标准：全部仪器校验合格，处于校验有效期内。

5）记录：填写附件 2《仪器设备校验确认记录》。

6.3 文件确认

1）目的：确认验证所使用方案、操作规程为生效受控版本。

2）方法：查阅文件受控状态。

3）可接受标准：所用文件已批准生效，为现行版本。

4）记录：填写附件 3《文件确认记录》。

6.4 实验材料与器材确认

1）供试品：待验证工艺中间产品，需完成3 次独立的方法适用性试验。

2）验证标准菌株：金黄色葡萄球菌 ATCC6538、铜绿假单胞菌 ATCC9027、枯草芽孢杆菌 ATCC6633、白色念珠菌 ATCC10231、巴西曲霉 ATCC16404。

3）培养基、缓冲液：胰酪大豆胨琼脂培养基；pH7.0 氯化钠‑蛋白胨缓冲液；巴西曲霉菌悬液制备使用添加 0.05% 聚山梨酯 80 的 pH7.0 氯化钠‑蛋白胨缓冲液。培养基需完成培养基适用性检查。

4）试验器材：微生物限度过滤器、滤杯、底座、无菌滤膜、无菌镊子、移液枪、灭菌枪头、L 型涂布棒、平皿等，确认灭菌合格、在有效期。

5）记录：填写附件 4《实验材料记录》。

6.5 菌悬液制备

菌悬液制备同时满足ChP、USP〈61〉相关要求，目标菌悬液每 0.1mL 含菌量：10 cfu～100 cfu。

6.5.1 传代保藏菌株菌悬液制备

试验菌株按标准要求复苏传代得到新鲜培养物；使用 pH7.0 氯化钠‑蛋白胨缓冲液（巴西曲霉采用含 0.05% 聚山梨酯 80 的 pH7.0 氯化钠‑蛋白胨缓冲液）或 0.9% 无菌氯化钠溶液进行梯度稀释，制备得到菌数不大于 100 cfu/mL 的工作菌悬液，现配现用。

6.5.2 定量冻干 ATCC 菌株菌悬液制备

1）未开启菌株西林瓶平衡至室温；pH7.2 无菌磷酸盐缓冲液预热 34℃‑38℃；

2）无菌操作取出菌株丸体转移至预热缓冲液，密封；3）置于 34‑38℃水浴或培养箱水化 30min，保证菌株充分水化；

4）水化结束后充分混匀，进行 10 倍梯度稀释，制备得到每 0.1mL 含菌量 10～100cfu 的菌悬液；

5）可采用涂布法或者倾注法对菌悬液进行计数确认。

7 试验实施内容

采用薄膜过滤法开展需氧菌总数计数方法适用性试验；每组菌株平行 2 个平皿；试验分为：试验组、菌液对照组、供试品对照组、阴性对照组；共开展 3 次独立试验。

7.1 试验组

1）操作：滤杯中加入 pH7.0 氯化钠‑蛋白胨缓冲液润湿滤膜；量取供试品 20mL 加入滤杯过滤；加入 100mL pH7.0 氯化钠‑蛋白胨缓冲液冲洗滤膜；加入 0.1mL 试验菌悬液（10‑100cfu），完成过滤；

2）取出滤膜，菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板，每种试验菌株平行制备 2 皿；

3）培养条件：

• 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌：30～35℃培养，不超过 3 天；

• 白色念珠菌、巴西曲霉：30～35℃培养，不超过 5 天；

4）培养结束后进行菌落计数。

7.2 菌液对照组

1）操作：缓冲液润湿滤膜；加入 100mL 无菌 pH7.0 氯化钠‑蛋白胨缓冲液，加入 0.1mL 对应试验菌悬液（10‑100cfu），过滤；

2）滤膜菌面朝上贴胰酪大豆胨琼脂培养基平板，每种菌株平行 2 皿；

3）培养条件同 7.1；培养结束菌落计数。

意义：反映无供试品干扰条件下菌株正常回收水平。

7.3 供试品对照组

1）操作：缓冲液润湿滤膜；取供试品 20mL 过滤，使用 100mL pH7.0 氯化钠‑蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，冲洗 1 次；过滤完成，滤膜贴于胰酪大豆胨琼脂培养基；平行制备 2 皿；

2）培养条件：30～35℃培养不超过 5 天；计数。

意义：测定供试品本底菌落数，用于回收率计算扣除。

7.4 阴性对照组

1）操作：滤杯中加入 100mL 无菌 pH7.0 氯化钠‑蛋白胨缓冲液，过滤；滤膜贴胰酪大豆胨琼脂培养基，平行 2 皿；

2）30‑35℃培养不超过 5 天，菌落计数。

意义：确认耗材、缓冲液、操作过程无外源微生物污染。

7.5 结果计算

将全部培养过程、菌落计数结果记录于附件 5《方法适用性试验记录》。

回收比值计算公式：

回收比值 =（试验组平均菌落数−供试品对照组平均菌落数）÷ 菌液对照组平均菌落数

7.6 试验有效性与结果判定

1）试验有效前提：阴性对照组无菌落生长，试验方为有效。若阴性对照长菌，本次试验无效，需要调查污染来源后重新试验。

2）可接受标准：每一次独立验证试验中，各试验菌株回收比值应在 0.5～2.0 范围内；

3）3 次独立试验均满足回收比值要求，说明该薄膜过滤法适用于本供试品中间产品的需氧菌总数检测，可使用该方法开展样品日常微生物限度检测。

4）若供试品对照组检出菌落，其结果应符合该供试品质量标准。

备注：若任意一次试验某菌株回收比值不在 0.5‑2.0 范围，说明现有方法不能消除样品抑菌，需要优化冲洗体积、冲洗液组成、供试品处理方式，重新开展适用性试验。

8 偏差处理

验证实施过程中出现任何偏离本方案、SOP 的情况，按照企业《偏差处理规程》执行，开展调查、评估影响，采取纠正预防措施，必要时重新开展试验；重大偏差需经质量负责人批准。

9 变更控制

当发生供试品工艺、配方、检测方法、冲洗条件、滤膜参数等变更，需要评估是否重新开展微生物限度方法适用性验证；变更管理执行企业《变更控制管理规程》。

10 验证周期

1）常规：当检测方法发生改变、供试品生产工艺发生重大变更时，应重新开展本方法适用性验证；

2）无变更情况下，无需重复验证。

本文章仅供参考。