ISPE：生物反应器污染调查的最佳实践

生物反应器污染调查的最佳实践

Best Practices for Bioreactor Contamination Investigations

作者：David Marks（PS&S Architects and Engineers 高级项目负责人，拥有 35 年以上行业经验） ｜ 来源：ISPE《Pharmaceutical Engineering》2026 年 9/10 月刊 · Technical 栏目

生物反应器污染（bioreactor contamination）可能是 GMP 生产设施中最棘手、代价最高的偏差事件之一，其原因既在于细胞培养（cell culture）单元操作本身易受污染，也在于追溯污染来源极为困难。

本文基于作者过去三十余年参与大量污染调查的经验，提出一套用于污染调查的最佳实践方法，并总结一些最常见的设备相关原因，重点聚焦细菌、霉菌、酵母、病毒和支原体等外来因子（adventitious agents）污染。

背景（BACKGROUND）

生物反应器污染可能源于人员、程序、物料或设备中一个或多个环节的失效（见图 1）。污染事件可能呈间歇性发生，也可能由多个根本原因或多种因果事件的组合所致。除非组织能够快速锁定根本原因并加以纠正，否则接连发生的污染事件可能使生产运营长期中断。

图 1 ｜ 生物反应器污染潜在来源的通用分类鱼骨图

调查方法（INVESTIGATION APPROACH）

因污染而损失生产批次时，生产运营经理通常面临快速补批的压力。在调查开始之前，可能很想先启动设备换型（例如在位清洗［clean-in-place, CIP］、在位灭菌［steam-in-place, SIP］、培养基补加）以便为替代批次准备生物反应器。这正是为污染应急预案（contingency）提前规划的价值所在：预案要求优先在换型之前安排设备检查，并在受污染批次的加工细节（包括人工操作）在操作人员记忆中仍清晰时，捕获支撑调查的关键信息。

污染后的设备检查很重要，因为生物反应器的状态与设定可能提供污染来源的线索，因此必须在设备状态被改变之前进行检查。

及时的操作人员访谈同样重要，可以在交谈尚未扭曲任何人视角之前捕捉观察结果。尽早完成访谈也更有可能捕捉到那些在当时看似无关、却可能有助于引导调查方向或佐证污染推断的观察信息。访谈人员时应营造一种不评判的氛围，便于如实报告。应鼓励操作人员主动提供观察信息或承认与事件相关的差错。调查团队与运营管理层都应聚焦于解决问题，而非追究责任。

污染调查需要结构化方法，以捕获可供分析的数据，从中识别规律与相关性、确定潜在根本原因。这要求建立应对污染事件的标准程序，确保与污染相关的关键信息被记录在案，以支持调查及后续的纠正与预防措施（corrective and preventive action, CAPA）结论。

污染调查所需的系统分析，与侦破案件的科学方法类似。证据必须被收集、编目并系统分析，以重构污染发生前的事件过程。从这个意义上讲，污染调查中的侦破工作本质上是法证性的。如果未及时访谈人员，设备也未在事件发生后立即检查，那么用于确定根本原因的证据可能遭到破坏。应当建立程序化控制，确保人员作出恰当响应，并及时、系统地捕获和记录时效性信息。

还应记住：污染调查类似于风险评估，都在识别因果概率。极少数情况下污染原因能被确证性证据锁定。许多设备相关污染原因，实质上是削弱了旨在建立和维持无杂菌培养环境（axenic culture environment）的工艺过程的有效性，从而降低了外来因子被排除在工艺区域（process zone）之外的概率。这正是设备缺陷所致污染常呈间歇性的原因。多数情况下会识别出多个潜在原因，由此形成的 CAPA 旨在提高工艺稳健性，而并未绝对确定污染的直接原因已被解决。

调查范围（INVESTIGATION SCOPE）

污染调查程序应涵盖以下主题：

• 跨职能调查团队及支持方的范围与职责

• 收集相关批次数据和电子记录的程序；还应汇集与受污染设备相关的维护记录和既往 CAPA 记录，以及环境监测、厂房公用工程和楼宇自控系统记录中的相关数据

• 识别污染微生物外来因子及其污染时间的方法（通常依据批记录和留样检验推导）

• 受污染设备隔离要求，以防止与其他系统发生交叉污染

• 受污染培养物的灭活与处置标准操作

• 设备拆卸与检查程序，查找部件失效、清洁不充分或工艺区域完整性受损的证据

• 访谈操作人员并记录与事件相关的异常情况的标准程序

• 污染后生物反应器清洁与恢复使用的标准

历史数据分析（Historical Data Analysis）

追踪微生物污染最有用的工具之一，是分析受污染批次的历史数据。这些数据可用于编制污染发生前作业与事件的时间线。偏离常规生长曲线（例如 pH 或溶解氧需求出现异常变化）可提供线索，用以推断污染发生时的大致批龄。同样有益的做法是，将 CIP、SIP 等自动化程序的数据曲线，与设备最初确认（qualification）时建立的数据曲线进行比对。趋势偏差提供的线索有助于诊断可能促成污染的机械故障。

“偏离常规生长曲线（例如 pH 或溶解氧需求异常变化）提供了推断污染发生时大致批龄的线索。”

应维护一份全部污染事件的主数据库，记录日期、设备标识、批号、污染微生物、检出时批龄，以及最终确定的成因与 CAPA 措施。这将便于将最近一次污染与厂内既往污染进行比较，识别设备标识、污染微生物或生产工艺特定步骤之间的相关性。此类分析可通过在数据中寻找规律、识别可能的污染来源，帮助收窄调查范围。

污染物检测与鉴定（Contaminant Detection and Identification）

鉴定污染物菌种是调查的关键环节，可提供进一步收窄调查范围的线索。细菌和真菌污染相对容易通过监测培养物的关键工艺参数检出，而支原体（mycoplasma）和病毒（viral）感染可能需要专门的分析检验方法才能检出。污染物的生长特征可结合批次趋势与留样（retain sampling），用于判断污染发生的大致时间段¹。革兰阳性产芽孢菌更可能源自通气或灭菌失败，而水生革兰阴性菌更可能来自水性污染源²。

界定工艺区域（Defining the Process Zone）

设备调查范围通过界定受污染培养物的工艺区域（process zone）进一步收窄。由于生物反应器是密闭系统，工艺区域包括可能接触工艺或产品的所有设备与部件。这涵盖通常所称的生物反应器无菌边界（sterile boundary）——即将培养物与周围环境隔开的设备部件（例如生物反应器罐体或袋的内表面、接触产品的管道或软管、隔断阀、静密封与动密封、除菌过滤器）。工艺区域还可延伸至运行期间与生物反应器撬装（skid）相连的工艺设备，例如培养基过滤工作站、灌流（perfusion）装置、工艺转移管线，以及用于缓冲液、培养基、接种物和化学添加物的容器。关于工艺区域与污染控制的总体讨论见 ISPE Baseline® 指南《生物制药生产设施》³。

调查范围应检查工艺区域的完整性，以及使工艺区域不含外来因子的工艺操作的有效性。对于一次性生物反应器（single-use bioreactor, SUB），重点在于制造商对一次性组件的 γ 辐照（gamma irradiation）灭菌；对于多次使用的不锈钢生物反应器，重点则在于清洁与灭菌工艺的设计。

一次性生物反应器（Single-Use Bioreactors）

对所有接触产品的表面采用一次性技术（single-use technology, SUB），可免除设备清洁需求，并实质上将工艺区域灭菌“外包”出去。一次性生物反应器简化了调查，但并未完全消除设备调查范围。由于一次性袋体具有半透明特性，目视观察异常浊度或起泡有助于发现污染，并推断受污染时的批龄。一次性生物反应器的工艺区域完全由一次性组件构成（例如反应袋、搅拌器、传感器、管路、无菌连接器、补料口组件），因此这些是调查的重点。观察并记录一次性组件状态（是否存在泄漏或异常物料积聚）至关重要。

美国机械工程师学会（ASME）的生物加工设备（BPE）标准为一次性组件的货架期、储存和有效期提供指导⁴。应调查每套一次性组件，确认使用符合有效期、储存要求以及制造商提供的任何特殊处理要求。调查应包括对一次性组件储存与运输条件（例如温度或光照暴露）的审查。还应核查批记录，确认操作条件低于一次性组件额定最高温度、压力和工作体积限值。若供应商无法提供这些信息，组织应考虑未来改用符合 BPE 标准的供应商。

一次性生物反应器污染可由多种失效机制引起。最常见的失效与容器完整性被破坏有关，该破坏在反应袋被充满并开始泄漏之前可能一直未被察觉。一次性组件可能在仓库储存、向生产车间搬运或操作人员物理安装过程中受损。在生产规模一次性系统中，供应商通常会提供专用装置和规程，以便在不损坏反应袋的情况下完成安装和充胀。ISPE《良好实践指南：一次性技术》列出了可在培养基灌装（media fill）前或污染后用于验证系统完整性、检测泄漏的容器密闭完整性测试方法⁵。

“对所有接触产品的表面采用一次性技术，可免除设备清洁需求，并实质上将工艺区域灭菌‘外包’出去。”

污染还可能源于受污染的补料、不当的无菌管路连接，或灭菌不充分的一次性组件。生产规模的一次性生物反应器通常以电离辐射（ionizing radiation）预灭菌方式交付。一次性生物反应器灭菌失败极为罕见，但并非不可能。

对受污染一次性装置完成初步检查后，应联系一次性生物反应器供应商，确认符合性证书（certificate of conformance）上的批号标识是否关联过类似失效。应索取所用特定袋体的生产记录与质量控制数据。征询供应商协助调查也是明智之举。供应商对所用一次性设计的使用经验，可能提示对调查有益的额外调查方向。与多次使用组件（例如不锈钢反应罐）配合使用的一次性组件（例如补料袋、取样组件）也需要类似的调查路径。

多次使用生物反应器（Multiuse Bioreactors）

针对设计为可清洁、可灭菌并多次使用的生物反应器系统的污染调查，需要严谨分析 CIP 和 SIP 数据，以评估潜在失效模式。清洁失败有带来上一批次污染残留（carryover）的风险，并可能使工艺区域内的污物（soil）累积到足以在蒸汽灭菌过程中庇护外来因子的程度。灭菌失败则发生在 SIP 期间工艺区域某处累积热暴露（F₀）不足，或饱和蒸汽的直接暴露受阻时。CIP 和 SIP 工艺可能相当复杂，通常高度自动化以排除人为差错并增强可重复性。然而，设计缺陷、维护不善、设备失效和人工设备设定差错仍可能带来诸多微生物污染机会。

生物反应器操作（Bioreactor Operations）

生物反应器旨在密闭系统中长时间维持无杂菌培养物。生物反应器设计区别于其他 GMP 设备的最大挑战在于：其工艺区域刻意营造促进生长的环境，为外来因子提供了理想的繁殖条件。建立并维持排除微生物污染物的工艺区域环境，要求对细节一丝不苟，且每次都必须毫无差错地执行。

生物反应器的清洁与灭菌应涵盖工艺区域的每个表面，包括表面下方区域和生物反应器顶部空间（headspace）内的区域。CIP 和 SIP 操作都需要精确的阀门顺序控制，以引导流体流经各条流路。当微生物污染在运行早期被检出时，设备清洁与灭菌很可能是失效模式。

在位清洗（CIP）

生物反应器 CIP 失效会因工艺污物随时间累积而损害工艺区域的完整性。稳健的 CIP 设计不依赖冲击（impingement）去除污物，目标是使每个工艺区域表面在一致的化学组成、温度和暴露时间下得到均匀覆盖。当识别到慢性清洁问题时，调查可扩展至设备设计评估，以确保现行 GMP 得以落实。

可能导致污染的部分常见 CIP 设备失效包括：

• CIP 前设备设定不当

• CIP 系统未能以规定的化学浓度和温度输送清洁剂

• 未能产生规定压力和流量要求的流体流动，以冲刷被阻塞的支管（防止死角［dead legs］）并从工艺管路中排出空气

• 喷淋装置对罐体覆盖不足

• 喷淋装置中被异物（例如垫圈）堵塞

• 由于缺乏工艺隔离（例如缺少防混阀［Mixproof］或双关断双排放［block and bleed］阀组），来自 CIP 供液或其他非无菌公用工程的交叉污染

• 在下次使用前超出经确认的 CIP 清洁保持时间（clean hold time）

在位灭菌（SIP）

生物反应器 SIP 操作通过让微生物暴露于特定时长、结合温度与湿度的环境中将其灭活。SIP 可能因温度偏低、饱和蒸汽暴露不足、冷凝水排放不足、空气排除不足或蒸汽暴露时间不足而受损。生物反应器 SIP 通常通过一条或两条主路径将纯蒸汽（clean steam）引入罐体，其余路径则通过切换阀门间歇向罐内通汽，或打开相应阀门从罐内排汽。稳健的设计会建立可预期的压差梯度以维持足够的蒸汽流量，确保在经确认的保持期内，工艺区域内任何位置都不会低于灭菌温度。

可能导致污染的部分常见 SIP 设备失效包括：

• SIP 前设备设定不当

• 纯蒸汽系统未能持续输送压力合格、品质合格的饱和纯蒸汽

• 蒸汽分配不均而无法维持温度（例如管路堵塞、阀门失效、蒸汽流经阻力不等的并联路径）

• SIP 过程中截留空气

• 被阻塞的支管形成死角，蒸汽暴露不足

• 表面缺陷阻碍蒸汽充分渗透而无法灭活微生物

• 冷凝水排放失败（例如疏水阀失效）

• 在下次使用前超出经确认的 SIP 无菌保持时间（sterile hold time）

工艺转移（Process Transfers）

进出生物反应器的任何流体转移都可能破坏工艺区域完整性，包括接种、培养基装填/补料、用于 pH 和消泡控制的试剂，以及用于供氧和 pH 控制的气流（气体鼓泡、顶部吹扫和排气）。当流体经除菌级过滤器（sterilizing grade filter）除菌时，调查范围应包括过滤器组件的 SIP 与完整性测试（integrity testing）工艺。

在补料通过过滤、高压灭菌或 SIP 预灭菌的应用场景中，调查应评估灭菌方法的效力、与生物反应器相连容器的完整性，以及连接方式的完整性（例如一次性无菌连接器、无菌管路焊接、SIP 硬管连接）。细胞培养基通常在非无菌条件下配制，并在确认的时间窗内经除菌过滤。由于培养基促进生长，应特别关注设备和程序控制，以在配制过程中减轻生物负载（bioburden）。

设备检查（Equipment Inspection）

污染事件发生后，设备在恢复使用前应接受彻底检查。建议进行目视检查和保压试验（pressure hold test），以识别任何外部泄漏，并验证隔离工艺区域阀门和接头（fittings）的完整性。

安装与设定（Installation and Setup）

污染调查的第一步是确认设备配置仍然符合支持工艺验证的安装确认（installation qualification, IQ）。如果设备在出现一系列污染前已有成功的运行历史，则应更加关注近期设备配置或操作程序上的任何变更是否带来了意外后果。设备在常规操作和维护后的重新组装，可能不符合原始确认状态。即使是设备组装上的细微变化（例如管路坡度或阀门朝向），也可能损害系统的可排放性（drainability），从而削弱 CIP 和 SIP 操作的有效性。

制造商的交接文件包（turnover documentation package）应包括总体布置图（general arrangement drawing）和管道及仪表图（piping and instrumentation diagram, P&ID）。组织可借助这些文件开展系统性检查，识别与初始安装的任何偏差。对为适应新产品或新工艺而进行的近期改造应予以重点审视。即使是被认为“同类替换”（like-for-like）的部件更换，以及既往的 CAPA 措施，也应重新检查。

密封完整性（Seal Integrity）

密封件是生物反应器无菌边界中最薄弱的部件。卫生型密封（hygienic seal）旨在提供无缝接头，防止泄漏并避免会妨碍清洁和灭菌的产品滞留（entrapment）。然而，密封件会随时间老化，并可能在安装过程中受损或变形。卫生卡箍接头（hygienic clamp union）的垫圈尤其容易因卡箍错位（ferrule misalignment）或过紧而受损（见图 2）。应检查所有保护工艺区域的密封件（例如卫生垫圈、O 型圈、阀膜片或机械密封），判断是否存在老化、挤出（extrusion）或完整性受损的证据。若工艺区域边界外侧存在工艺残留物，应予以记录并擦拭取样（swab），检验其是否与最近一次污染的微生物匹配。

图 2 ｜ 密封失效是生物反应器污染的常见原因（照片：密封垫圈内缘缺损撕裂）

当检测到密封泄漏时，需进一步调查以确定污染根本原因。密封泄漏的潜在因素可能包括：替换密封件的存放年限与储存条件、服役时间、暴露于 SIP 和 CIP 条件的总时长、预防性维护频率，以及密封件安装的标准程序。密封完整性可通过多种方法（例如保压、氦检漏［helium leak testing］）在使用前后进行挑战测试。治理慢性密封完整性问题，需要对与生物反应器设备操作和维护相关的所有工艺与程序进行全面审查。

设备状态（Equipment Condition）

建议对生物反应器进行拆卸，以检查接触产品的表面是否存在可能损害 CIP 和 SIP 操作有效性的损坏、腐蚀或表面不规则。对于大型生产用生物反应器，可能需要进罐（tank entry）检查，以彻底检查所有接触产品的表面。应查阅设备维护日志，确认预防性维护已及时完成。若调查揭示部件失效存在某种规律，则可能证明需要调整维护频次或程序。

设备测试（Equipment Testing）

除目视检查外，还可通过测试进一步挑战生物反应器工艺区域的完整性。在设备配置允许的情况下，可采用局部水压测试（用于挑战阀门密封）和使用后过滤器完整性测试。氦检漏可精确定位难以发现的泄漏。CIP 覆盖测试可帮助验证生物反应器喷淋装置按设计运行。同样，可使用温度指示棒（temperature indicating sticks）、孢子条（spore strips）或热电偶温度测绘（thermocouple temperature mapping），在 SIP 期间最可能遭遇蒸汽暴露不足的位置评估 SIP 有效性。无菌/培养基保持研究（media hold studies）可证明生物反应器在恢复使用前维持无菌密闭系统的能力。污染后测试的行业实践因操作规模、污染历史和业主偏好而异。

案例研究（A Case Study）

可依据既往污染调查的经验构建一个假设性案例研究，以说明典型的根本原因分析过程。一家生物制药制造商的一台不锈钢生产用生物反应器系统在成功运行数年后，发生了一系列污染事件。首次污染后，该生物反应器被迅速清洁和灭菌，以接种新批次，并加强审查，确保所有标准操作规程均得到正确遵循。后续污染事件表明，问题始终与三台种子链（seed train）相同、设备设计相同的生产用生物反应器中的同一台相关。操作人员提高了后续运行的 SIP 温度，但无济于事。最终确定，污染事件始于最近一次预防性维护停机之后不久。

制造商随后启动了严谨的污染调查，包括拆卸并检查表面下搅拌系统。调查发现，搅拌器密封壳体组件的内侧 O 型圈密封（inboard O-ring seal）在安装时受损并失去完整性。由于外侧次级密封阻止了泄漏，该破坏未被保压试验检出（图 3）。清洁并更换密封件后，搅拌器组件重新安装，后续运行均无污染。

图 3 ｜ 案例研究搅拌器密封设计示意图（剖面：搅拌器密封壳体、内侧 O 型圈密封、搅拌器容器法兰、容器壁、外侧 O 型圈密封）

设计表面下冗余密封的初衷，是用于包容内侧主密封的灾难性失效。然而，当内侧 O 型圈受损时，两道密封之间的环形空间（annulus）便成为工艺区域中无法清洁和灭菌的一部分，从而导致培养物污染。本案例说明，多个因素——包括设备设计、维护程序和人为差错——如何共同作用而损害生物反应器完整性。在本案例中，设备设计还影响了密封破坏的可检出性。

拆卸搅拌器密封壳体组件属于劳动密集型工作，通常只在预防性维护中每年更换机械密封时进行。在本测试案例中，拆卸并目视检查密封壳体组件上的生物反应器密封件，是识别内侧密封失效的唯一途径。如果没有充分理由（例如需要容纳生物危害性培养物）保留冗余密封设计，一项 CAPA 响应建议可以是：在后续运行中移除外侧密封，使内侧密封失效能够通过常规保压步骤被检出。这将提供一种预警信号，使主密封泄漏能够及早被发现。

结论（CONCLUSION）

设施 GMP 合规要求制定、应用并维护污染控制策略（contamination control strategy, CCS），以管理产品安全风险⁶。生物反应器因其易受污染的特性，通常需要严格的控制。生物反应器污染事件总是具有破坏性且代价高昂。良好的 CCS 既为成功的风险缓解做规划，也为失效情形做应急准备。当具备稳健的设施、设备、物料和程序控制时，可靠、无污染的生物反应器运行是可以实现的。组织应将生物反应器污染事件视为重新审视工艺风险评估、建立或完善控制措施以降低未来复发概率的契机。

关于作者（About the Author）

David Marks 是 PS&S Architects and Engineers 公司的高级项目负责人（Senior Project Executive），拥有超过 35 年的生物制药设施设计经验，并长期参与生物反应器污染调查工作。

参考文献（REFERENCES）

1. Muralidharan, N. "Investigating Bioreactor Contamination, Modeling Contaminate Introduction, and Ensuring Bioburden Test Reliability." BioPharm International 38, no. 3 (2025): 20–4.

2. Blackwell, J. "Troubleshooting Bacterial Contamination in Bioreactors." Bioprocess Online, 31 January 2017.

3. International Society for Pharmaceutical Engineering. ISPE Baseline® Guide, Vol. 6, Biopharmaceutical Manufacturing Facilities, 3rd ed. North Bethesda, MD: ISPE, 2023.

4. American Society of Mechanical Engineers. ASME BPE-2024, Bioprocessing Equipment. Chapter 7, 279–82.

5. International Society for Pharmaceutical Engineering. ISPE Good Practice Guide: Single-Use Technology. North Bethesda, MD: ISPE, 2018.

6. European Commission. "EudraLex, Volume 4: EU Guidelines for GMP for Medicinal Products for Human and Veterinary Use, Annex 1: Manufacture of Sterile Medicinal Products." 2022.