一、原理

革兰氏染色法由丹麦医师Hans Christian Gram于1884年创立，后经改良形成现今通用的结晶紫法，是微生物学中最常用的鉴别染色方法，常用于未知细菌的初步鉴定。染色流程分为四步：结晶紫初染，所有菌体均着紫色；碘液媒染，在细胞内形成不溶于水的结晶紫-碘复合物；乙醇脱色，两类细菌在此步骤呈现不同的染色结局；沙黄复染，被脱色的菌体着红色。脱色后保留紫色者为革兰阳性菌，最终呈红色者为革兰阴性菌。

两类细菌染色结局的差异源于细胞壁结构：

要点归纳：革兰阳性菌厚层肽聚糖截留结晶紫-碘复合物，呈紫色；革兰阴性菌外膜脂质被乙醇溶解、薄层肽聚糖不能阻留复合物，经复染呈红色。

应当指出，革兰氏染色的机理尚未完全阐明，现行参考书籍中并存等电点学说、化学学说与渗透学说三种解释。这一认识对操作具有实际意义：染色反应是菌体生理状态与操作条件共同作用的输出，并非仅由遗传属性决定的确定性结果。同一菌种，可因培养状态与脱色程度的差异呈现不同的革兰反应。革兰染色反应主要取决于细胞壁的厚度，而非细胞包被的层数，因此革兰反应并不总是与细胞包被结构相关联。既然反应由厚度这一连续变量主导，培养条件与脱色操作足以使结果发生偏移，便有了结构层面的解释。

二、操作

关于脱色时间与复染时间的特别说明：各规程所载数值并不一致。本文操作表以WHO的SOP为基准（脱色约10~15秒、沙黄复染30秒）；Brock教材（图2）所载为乙醇脱色20秒、沙黄复染1~2分钟；国内教材及操作规程另见20秒、30秒乃至30~60秒。该差异源于脱色时长对涂片厚度、乙醇用量及滴加方式的依赖性。规范的做法并非采用某一固定计时数值，而是以"流下液体不再带紫色"作为脱色终点判断依据，并将该终点连同本实验室固定的涂片制备方式一并纳入SOP并经验证。乙醇浓度亦为变量之一：通常使用95%乙醇，无水乙醇脱色过快、不易控制（通行做法）。菌种间脱色耐受性亦存在差异：部分革兰阳性菌（如芽孢杆菌属某些种）较易被过度脱色，部分革兰阴性菌（如不动杆菌属）相对耐脱色，此类倾向仅作参考，仍以质控菌株对照结果为准（定性经验）。计时数值仅供参考，脱色终点方为判定标准。

三、注意事项

下表所列常见错误按后果严重程度排序，涵盖操作、培养物状态与试剂管理三方面：

异常结果原因速查（参考）

结果报告环节：同一视野内紫红两色并存时，可报告"革兰可变性"；必要时以氢氧化钾拉丝试验佐证，或取新鲜培养物重新制片染色，不建议主观判定为单一革兰反应。

质量控制环节：革兰氏染色的质控采用已知革兰反应的阴性、阳性菌株平行对照。WHO实验室质量管理体系分步实施工具（Laboratory Quality Stepwise Implementation，LQSI）网站所载示例SOP（模板文件，非WHO规范性出版物）给出的方案为：定期（该示例为每周一次，具体频次以实验室SOP为准）以已知革兰阳性的金黄色葡萄球菌和已知革兰阴性的大肠埃希菌制备质控片（常用标准菌株如ATCC 25923与ATCC 25922），阳性菌应呈蓝紫色球菌、阴性菌应呈红色杆菌；结果不符合要求时先重新染色质控片，仍不符合再排查试剂质量与操作过程，质控结果均应记录存档。在制药微生物实验室，SOP应覆盖三类触发情形：新配制或新开封染液投入使用前（碘液易失效，尤应注意）、定期质控、关键样品染色时同步设置阴性阳性对照片。质控菌株按药典菌种管理要求执行：来源可追溯、传代受控、纯度符合。

操作要点核查清单

1. 使用对数生长期新鲜培养物（可16-18小时），避免老化培养物导致革兰可变性
2. 涂片宜薄不宜厚——以干燥后隐约可辨的薄膜为宜
3. 碘液避光保存、定期更换，使用前经淀粉试验或质控菌株验证
4. 脱色以流出液体颜色为终点判据，不机械依赖计时——流下液体无紫色即终止并立即水洗（经验很重要）
5. 按SOP覆盖的三类触发情形设置阴阳双菌质控（常用金黄色葡萄球菌与大肠埃希菌标准菌株）
6. 质控结果异常时，同批样品染色结果不予采用，排查原因并重新染色