ECA GMP/GDP 问答 3.0 汇编，涵盖 FDA 验证与 ECA 微生物控制问答

问：某些产品（如透皮贴剂）的制造工艺具有比其他产品或工艺更高的中间物料拒收率，这样可以吗？

答：也许可以。这取决于拒收率的原因和一致性。许多透皮贴剂制造工艺比其他药品工艺产生更多废料（即理论收率更低）。这本身不应成为关注点。废料通常是由于卷料拼接、产线启动和停机、卷料更换的累积效应，以及可能更高的中间过程取样率造成的。这在涉及各组件层卷料层压的工艺中最为明显。例如，在卷料粘合剂涂布过程中检测到的卷料缺陷，通常只能在整片贴剂最终制造/层压后才能从卷料上剔除，这就形成了最终工艺废料流。

我们期望经过验证且受控良好的工艺能够实现批间相当一致的废料量。超出正常操作率的废料可能需要（见 21 CFR 21.192）进行评估，以确定原因（例如，由于取样增加或组件缺陷高于正常水平……或两者兼有），并评估对产品质量的后果。我们见过少数案例，异常高的批内拒收/损耗是由于组件质量变异性过大和工艺开发不足造成的。

References:

• 21 CFR 211.100：书面程序；偏差

• 21 CFR 211.103：收率计算

• 21 CFR 211.110：中间物料和药品取样与检测

• 21 CFR 211.192：生产记录审核

问：CGMP 法规是否要求在新的原料药（API）或制剂药品放行分销之前完成三批成功的工艺验证批次？

答：不需要。CGMP 法规和 FDA 政策均未规定验证制造工艺所需的最少批次数量。FDA 当前的 API 指南（见行业指南 ICH Q7 for APIs）也未规定工艺验证的具体批次数量。

FDA 认识到，验证制造工艺或对工艺的变更，不能简化为完成三批成功的大规模批次这样简单的公式。FDA 承认，“三批验证批次”的理念因过去 FDA 指南中的措辞而变得盛行。FDA 的工艺验证指南现在推荐采用产品生命周期方法。证明工艺经过验证的重点放在生产企业的工艺设计和开发研究，以及其在规模化下的重现性证明上，这一直是预期的目标。

但是，并未规定验证制造工艺所需的最少符合性（亦称验证）批次数量。期望生产企业对其选择有合理的论证。FDA 鼓励采用基于科学的工艺验证方法。

2004 年 3 月，FDA 修订了合规政策指南（CPG）Sec. 490.100《受上市前批准约束的药品和原料药的工艺验证要求》。该 CPG 描述了这样一种理念：在识别并建立对所有关键变异来源的控制后，制备符合性批次以证明在正常条件和操作参数下，该工艺能够生产可接受的产品。通常期望在商业分销开始之前完成初始符合性批次，但 CPG 中描述了一些可能的例外情况。例如，尽管 CPG 未具体提及供应短缺 API 的同步验证，但 FDA 会考虑在需要应对真实供应短缺情况时使用同步验证，且同步验证研究符合 CPG 中确定的条件（见第 4 段 a-c）。

CPG 中概述的条件包括针对每批旨在应对供应短缺情况的扩大检测。根据既定验证方案进行的扩大检测可以在 API 用于制剂药品之前，提供额外的保证，即该批次符合所有既定且适当的标准。此外，可通过加强取样（代表批次的更大样本量）以及可能检测额外属性，获得对 API 制造工艺的信心。检测每批（包括验证批次）都需要经过验证的分析方法。FDA 还期望生产企业使用验证方案，包含在多批完成后进行审评和最终报告，即使较早批次可能已被分销或用于制剂药品。

References:

• 21 CFR 211.100：书面程序；偏差

• 21 CFR 211.110：中间物料和药品取样与检测

• 合规政策指南 Sec. 490.100《受上市前批准约束的药品和原料药的工艺验证要求》

• FDA 行业指南，2001，ICH Q7《原料药优良生产规范指南》

• FDA 行业指南，2011，《工艺验证：通用原则与实践》

问：从 CGMP 角度看，采用无菌工艺生产的无菌药品生产企业，在设施确认时仅依赖 ISO 14644-1 和 ISO 14644-2 通常是否可接受？

答：不可接受。从 CGMP 角度看，采用无菌工艺生产的无菌药品生产企业，在设施确认时通常不能仅依赖 ISO（国际标准化组织）14644-1 第 1 部分：空气洁净度分级（14644-1）和 ISO 14644-2 第 2 部分：用于证明符合 ISO 14644-1 的测试和监测规范（14644-2）。相反，采用无菌工艺生产的无菌药品生产企业应将这两个 ISO 标准与适用的 FDA 法规、指南和其他相关参考文件结合使用，以确保药品设施处于适当的受控状态。因此，企业可能需要采取补充 ISO 建议的适当措施（例如结合微生物数据），以在药品设施中达到或超过 CGMP。

请理解，14644-1 和 14644-2 已取代联邦标准 209E《洁净室和洁净区空气悬浮粒子洁净度等级》（Federal Standard 209E）。2001 年 11 月，美国总务管理局取消了联邦标准 209E。

尽管 14644-1 和 14644-2 并非 FDA 法规或 FDA 指南，但 FDA 认为它们有助于促进多个行业（如计算机、航空航天、制药）非活性粒子洁净度的国际协调。因此，FDA 在 2004 年行业指南《采用无菌工艺生产的无菌药品——现行良好生产规范》中采用了这些粒子洁净度等级。然而，由于采用无菌工艺生产无菌药品具有独特性（如微生物问题），无菌工艺生产企业不应在设施确认时仅依赖 14644-1 和 14644-2。

References:

• 美国食品药品监督管理局网站

• 国际标准化组织网站（外部链接免责声明）

• ISO 14644-1 第 1 部分：空气洁净度分级

• ISO 14644-2 第 2 部分：用于证明符合 ISO 14644-1 的测试和监测规范

• FDA 行业指南，2004，《采用无菌工艺生产的无菌药品——现行良好生产规范》

• 21 CFR 第 211 部分：制剂药品现行良好生产规范

问：2004 年，FDA 发布了一份题为《PAT——创新药物开发、制造和质量保证框架》的指南，鼓励行业通过加强工艺控制实现制造现代化。我应如何实施 PAT（过程分析技术）？

答：FDA 的 PAT 计划的目标是促进 PAT 的采用。在 2004 年指南中，我们讨论了 FDA 促进行业采用现代化制造运营并加强工艺控制的新型有益技术的协作方法。FDA 认识到应鼓励生产企业迅速实施能够提高质量保证和工艺效率的新系统。因此，我们对 PAT 实施采取基于风险的方法，并包含多种选项：

(1) PAT 可在企业自身的质量体系下实施。由 PAT 认证检查员进行的 CGMP 检查可在 PAT 实施之前或之后进行。

(2) 作为另一种质量体系实施选项，FDA 邀请生产企业在实施前请求对其 PAT 制造设施和工艺进行运行前审查（见 ORA 现场管理指令 No.135）。

(3) 可在实施前向 FDA 提交补充申请（Changes Being Effected（CBE）、CBE-30 或 Prior Approval Supplement（PAS）），如有必要，可在实施前由 PAT 认证检查员进行检查。例如，当申请中建立的成品检测标准将发生变更时，应使用此选项。

(4) 可向 FDA 提交可比性方案（comparability protocol），概述 PAT 研究、验证和实施策略以及时间表。在对可比性方案中概述的总体策略进行协作审评后，监管路径可包括在企业自身质量体系下实施、运行前审查、CGMP 检查（PAT 实施前或后）、这些方式的组合或其他灵活方法。

生产企业应评估并与 FDA 讨论最适合的 PAT 实施选项（见下文问题 8 和 9）。

References:

• FDA 行业指南，2004，《PAT——创新药物开发、制造和质量保证框架》

• ORA 现场管理指令 No.135：制造设施运行前审查 修订日期：2013-9-16

问：我如何就 PAT 问题联系 CDER？

答：生产企业应联系 CDER 的药品质量办公室和/或相应的审评部门，讨论 PAT 对 CDER 监管产品的适用性。

进一步信息联系方式：

CDER 主要官员（Key Officials）

Date Revised: 2015-6-18

问：我如何就 PAT 问题联系 CBER？

答：生产企业应联系 CBER 相应的审评部门，讨论 PAT 对 CBER 监管产品的适用性。

进一步信息联系方式：

CBER 主要员工名录（Key Staff Directory）

Date Revised: 2013-9-16

问：与班次数量相关的可接受培养基灌装频率是多少？通常……

答：（注：源文在此处以 @@@ 源行 9817-9828 @@@ 边界截断，本问题的答案部分未包含在所提供的源文本中。）

Date: （源文未提供）

问：我注意到在实践中，验证要求的适用程度因产品的灵敏度而异。您对此有何评论？

答：验证应基于风险，并与主题相关，确保您能够证明经验证的系统能够持续运行并交付预期输出。

问：对于计算机化系统，数据完整性的所有方面都适用吗？

答：是的！

问：(i) “无菌过滤前微生物负荷通常接受 10 CFU/100 mL 的限度。您是否认为从 100 mL 样品开始，分别在 TSA 培养基上分析 50 mL、在沙氏葡萄糖琼脂（Sabouraud dextrose agar）上分析 50 mL，然后将两个结果相加，是提供 100 mL 微生物负荷结果的可接受方法？您是否知晓行业中使用这种方法以减少 QC 检测所用产品量的做法？”

(ii) “您是否也考虑将样品分成两个等份：一份在 TSA 上用于 TAMC（需氧菌总数），一份在 SDA（沙氏葡萄糖琼脂）上用于 TYMC（酵母菌和霉菌总数），并将两个结果相加？这样是否可接受？例如，对于 10 mL 样品，5 mL 用于 TAMC，5 mL 用于 TYMC；如果我们发现 TAMC 为 3 cfu，TYMC 为 2 cfu，则总量为 5 cfu/10 mL 样品？”

(iii) “API 微生物负荷检测的样品量通常为 10g。对于细胞毒性 API，样品量能否减少？是否有必要从这么高的量开始？如何论证这一点？”

答：对于薄膜过滤法，欧洲药典 2.6.12《非无菌产品的微生物检查：微生物计数试验》第 5 部分“产品的检测”（见子节 5-1. 检测用量和 5-2. 产品的检查）提供了指导：“除非另有规定，使用 10 g 或 10 mL 待检产品”以及“[……]将适量转移至每张滤膜并立即过滤。[……]为测定 TAMC，将其中一张滤膜转移至酪蛋白大豆消化琼脂表面。为测定 TYMC，将另一张滤膜转移至沙氏葡萄糖琼脂表面。”

这意味着，对于要求或内部定义的 10 mL 样品体积，TAMC 和 TYMC 各必须检测 10 mL。然而，欧洲药典描述了以下例外情况：“对于用作活性物质的物料，当样品数量有限或批量极小时（即少于 1000 mL 或 1000 g），除非另有规定或经论证并授权，检测量应为批量的 1%。”“对于批中实体总数少于 200 的（如临床试验用样品），样品量可减少至 2 个单位，若数量少于 100 则可减至 1 个单位。”（见 5. 产品的检测，5-1. 检测用量）。

建议与主管当局预先讨论并获其批准偏离上述规范的样品体积。

关于无菌过滤前的微生物负荷测定，《EMA 药品、活性物质、辅料和初级容器灭菌指南》对检测体积提供了指导。其中指出，应检测 100 mL 用于 TAMC，而 TYMC 未提及。通常认为，如果在方法适用性中能够证明代表性酵母菌和霉菌的回收，则仅检测 TAMC。USP 草案章节 <1119> 也暗示了这一点。检测体积 100 mL 如有论证也可减少。

问：1.2 行动限和标准限是否同一回事？例如，将 WFI（注射用水）的行动限设定为 10 CFU/100 mL 或 0.25 EU/mL 是否恰当？

答：不是——ICH Q6B 中的定义如下：

• 标准（Specification）：标准定义为一组检验、分析方法参考以及适当的可接受标准，这些标准是所述检验的数值限度、范围或其他标准。它确立了原料药、制剂或制造其他阶段物料为被认为适合其预期用途所应符合的一组标准。“符合标准”是指原料药和制剂按所列分析方法检测时将满足可接受标准。标准是由生产企业提出并论证、并由监管当局作为批准条件批准的关键质量标准。

• 行动限（Action limit）：用于评估较不关键步骤中工艺一致性的内部（厂内）值。

问：1.3 关于《Burkholderia Cepacia 复合群（BCC）非无菌产品微生物检查试验的拟议药典实施方法》，对水检测有何澄清期望？现行版本中“水的可选检测”表述含糊。

答：欧洲药典专论——无论是在水专论还是产品专论中——均不要求证明不存在 B. cepacia（洋葱伯克霍尔德菌）或 BCC 生物。然而，对于某些产品或产品类别，被 B. cepacia 或 BCC 生物污染可能对患者构成风险。但这必须基于产品或产品类别具体规定。在这些情况下，必须证明最终产品中不存在 B. cepacia 或 BCC 生物。

问：1.4 微生物负荷检测性能（幻灯片 14）：解释称 TSA 平板在 25-30°C 孵育 5-7 天，但 USP 草案章节写标准 TAMC 在 30-35°C 孵育 3-5 天。您的策略/理由是什么？

答：欧洲药典 2.6.12 和 USP<61> 已通过 PDG（药典讨论组）和 ICH 进程实现协调。在两个药典中要求如下：“将大豆-酪蛋白消化琼脂平板在 30° 至 35° 孵育 3 至 5 天，将沙氏葡萄糖琼脂平板在 20° 至 25° 孵育 5 至 7 天。”

注：如果经过适当论证和验证，也接受其他孵育方案。

问：1.5 您是否有支持仅使用 TSA 进行微生物负荷检测的依据（相对于欧洲药典 2.6.12 规定使用 TSA 和 SDA）？

答：已生成的数据显示，TAMC 适用于检测包括酵母菌和真菌在内的广泛需氧微生物。这些数据已与全球众多监管当局讨论。基于这些结果，监管当局已批准在生物制药生产工艺的微生物控制中单独使用 TAMC。

问：1.6 在实践中，您如何处理样品保存时间超出的情况？您是否生成微生物生长动力学数据以支持风险评估？如果是，您如何支持研究中包含的微生物的选择？

答：如果超出样品保存时间，该样品被视为无效，导致“微生物负荷缺失”事件。如果您因计划中的工艺（如外部实验室）而面临超出保存时间的风险，应预先验证充分的样品保存时间。

问：1.7 在保存时间考虑中，您是否也考虑光照暴露？

答：不考虑。

问：1.8 您是否验证大规模制造中的累积保存时间？

答：不验证。

问：1.9 为建立生产批量保存时间（例如，从配料开始到第一次过滤结束之间的保存时间），应取样多少批次？

答：三个批次。

问：1.10 与微生物负荷数据完整性相关的监管期望。平板计数是否需要第二复核人员？

答：理论上，需要。对于某些微生物负荷取样点，可基于风险评估免除同期复核。BioPhorum 的《需要同期复核的传统基于培养的微生物检测的风险评估》提供了此类风险评估的指导。当前 USP <1117> 修订草案遵循这一理念。

问：1.11 (i) “当产品标准须报告为合并的 TAMC 和 TYMC 时，是否应计数每张平板的所有菌落，无论微生物类型均求和并报告？我的意思是：

答：罗氏（Roche）和诺华（Novartis）均不进行 TYMC 计数。因此，这方面与我们无关。（Neither Roche nor Novartis perform a TYMC count. Hence, this aspect is irrelevant for us.）

问：1.12 (i) “是否需要对药品制造工艺的每个步骤进行 SDA 监测？还是 TYMC 标准仅用于产品放行？”

(ii) “TYMC 是否真正用于无菌产品的中间过程（IPC）微生物负荷检测？”

答：卫生当局已接受我们对所有 IPC（中间过程控制）水平和原料药（Drug Substance）仅使用 TAMC 进行检测。

问：1.13 (i) “为证明 TAMC 足以回收我们环境中最可能的微生物（MO），应进行哪些研究？”

(ii) “是否公开了为证明在这些孵育条件下大多数酵母菌和霉菌可在 TSA 上回收而开发的试验？”

(iii) “从未期望证明任何霉菌或酵母菌会在您的孵育条件下在 TSA 上生长？”

答：我们未执行任何特定研究。酵母菌和霉菌已包含在我们的方法适用性试验中，这些实验和结果足以使卫生当局允许我们免除 TYMC。

问：1.14 为在 TSA 上回收酵母菌和霉菌，是否应修改孵育条件？

答：不需要——我们在 30-35°C 孵育。

问：1.15 (i) “您是否在某处证明了微生物负荷样品 24 小时的保存期对样品代表性没有影响？”

(ii) “您说微生物负荷样品 24 小时保存期并非总被接受。您能否分享一些例子？”

答：没有——卫生当局在无需支持性实验数据的情况下接受了 24 小时保存期。

问：1.16 (i) “对于 IPC 微生物负荷的适用性/验证 = 在多少个不同批次上使用多少本地分离株？”

(ii) “您向生长促进试验（Growth Promotion Test）中加入何种类型和数量的本地菌株？”

答：微生物负荷方法适用性试验中必须包含两种厂内（in-house）分离株。

问：1.17 指定 TAMC 的孵育条件：温度和持续时间？

答：30-35°C 孵育 3–5 天。注：使用经验证的自动菌落计数器时，孵育时间仅为 36 小时。

问：1.18 对于微生物负荷过滤法，若无生长检出，对于标准限度为 ≤10 CFU/10mL 的样品，结果应报告为 0 CFU/10 mL 还是 <1 CFU/10 mL？

答：您可以报告 0 CFU/10 mL 或 <1 CFU/10 mL。您的内部检测方法必须定义报告方式。

问：1.19 温度 5°C 比时间对微生物负荷更重要……那么 48 小时最大保存期但保持在 5°C 且无数据呢？（注：向诺华同事的明确提问）

答：样品保存时间已与众多当局讨论，并最终商定为 24 小时保存期。该样品保存时间已在申报资料中描述并为当局所接受。

问：1.20 您是否有微生物负荷的复测样品，如何使用？

答：如果超过已定义并归档的微生物负荷样品保存期（注：24 小时），我们将不再拥有有效样品。

问：1.21 当适用无菌和 LAL（鲎试剂法）检测时，DP（制剂）放行的保存时间？从取样到检测要求 24 小时，但灌装与检测之间是否有任何保存时间限制？

答：通常，无菌检测样品未定义样品保存时间。应执行“内毒素回收研究”，以评估是否存在任何样品特异性的内毒素掩蔽效应，从而需要为内毒素样品定义样品保存期。

问：1.22 对于商业前涵盖三批的 III 期验证，当验证活动正在进行时，能否将 IPC（中间过程控制）例行结果用于放行？还是应在例行 IPC 结果可用于放行之前完成涵盖所有 IPC 步骤的方法验证？

答：在放行任何物料之前，必须完成所有验证工作。

问：1.23 在微生物负荷方法适用性试验中使用厂内菌株（Sven 等人提及）的理由是什么？（注：向罗氏同事的明确提问）

答：所使用的微生物负荷检测方法应能够检测与您的制造工艺及相应设施/制造环境相关的微生物。这将通过在本方法适用性试验中包含代表性的厂内分离株来证明。

问：2.1 (i) “微生物负荷的下限标准是什么？标准小于 1 的微生物负荷不现实？（由于环境、耗材和检测设备）？那么下限标准应该是多少？小于 3？小于 5？”

(ii) “关于微生物负荷限度：在 D 级、C 级和 B 级中取自 BDS（散装药品溶液）生产的样品以无菌方式采集，并在非分级微生物实验室中分析。偶尔，在采集或处理平板上会出现几个菌落。在此情况下，设定 <1 CFU/10 mL 的微生物负荷限度是否有意义，或者您会建议什么？”

答：定义了限度的逐步递进。更接近工艺末端设置更严格的限度，若 DS（原料药）为冷冻状态则为 ≤ 10 CFU/10 mL。

问：2.2 (i) “您是否对每个定义的取样点都进行了微生物负荷方法适用性试验？还是采用了基于最差情况样品（中间体/缓冲液干扰检测的概率）的方法来覆盖其他一些步骤，并基于风险评估减少方法适用性试验工作量？”

(ii) “当局和检查员——他们在多大程度上期望监测整个缓冲液/原料药/制剂工艺中微生物负荷的控制，这全部是基于风险的吗？”

答：是的，对每个定义的取样点都进行了方法适用性试验。采用基于风险的方法定义取样点，考虑例如（包括但不限于）：(i) 工艺设备的配置，包括微生物负荷降低过滤器的布置，以避免检测污染物时的潜在盲点；(ii) 开放式工艺步骤及周围环境；(iii) 调节步骤（如极端 pH 调整或溶剂/洗涤剂添加）对假定微生物负荷潜在失活的潜在影响必须考虑；(iv) 工艺池（process pool）的生长促进能力。

问：2.3 经无菌过滤接收的缓冲液在用于制造前是否应检测微生物负荷？我们已经检测了内毒素。

答：没有要求这样做的标准。如果缓冲液的无菌性是强制性的，那么也应通过证书验证或通过检测证明。

问：2.4 (i) “是否应为无菌生产采集的所有微生物负荷 IPC 设置警戒水平（alert levels）？”

(ii) “对于 C-D 级洁净室中的无菌生产，您是否仍建议为所有 IPC 步骤设置警戒水平？还是警戒水平仅在 A-B 级无菌生产时才要求 IPC 步骤？”

答：是的。

问：2.5 池的 pH 调节工艺（如病毒灭活）是否会掩盖其中微生物负荷或内毒素的存在？我的意思是，是否可能在执行病毒灭活前的池样品微生物负荷分析中检出微生物负荷，而在病毒灭活结束后检不出？

答：是的——调节步骤（如极端 pH 调整或溶剂/洗涤剂添加）对假定微生物负荷潜在失活的潜在影响必须考虑。

问：2.6 您是否总是与微生物负荷并行取样并检测内毒素？如果不是，为什么？（注：向诺华同事的明确提问）

答：不总是，但在大多数情况下是。注：EMA《药品、活性物质、辅料和初级容器灭菌指南》不要求在无菌过滤前检测内毒素。仅要求微生物负荷控制。

问：2.7 如果所有 IPC 步骤都要求警戒水平，那么这是否适用于所有产品阶段（I-III 期、PPQ 和商业）？如果仅生产了少量批次，您如何为 I-III 期和 PPQ 建立警戒水平？

答：是的。在开发期间使用临时限度，直到生成足够的历史数据。或者，对于不常生产的产品（如开发中），可使用来自相似工艺的数据。

问：2.8 由于微生物负荷是在过滤灭菌前取样，产品尚非无菌，因此某些检查员希望我们应用更适用于生物 DS（原料药）的全部期望。这相关吗？您会建议什么？

答：限度逐步递进的理念也应应用于 DP（制剂）制造。因此，应用于制剂制造的限度不应比为原料药定义的限度更宽松。限度的逐步递进。

问：2.9 微生物负荷（及其副产物）对所用生产设备的影响如何？对于微生物计数；是否有任何指南/依据来评估树脂/UFDF（超滤/透析过滤）膜再次用于制造工艺的安全性？如果事件为 TNTC（无法计数）且无法进行任何计算，是否有任何方法（例如某种空白运行研究）来论证该副产物无影响？

答：清洁和消毒操作应足够严格以去除污染物及任何副产物。清洁和消毒措施的有效性必须在清洁验证中证明，并须在例行工作中建立对清洁和消毒措施的监测。

问：2.10 关于制造的保存时间限度，是否重要为每个工艺步骤定义保存时间？还是从微生物学角度看，整体保存时间（至灭菌开始前的所有工艺步骤）才是关键？

答：是的。必须为每个工艺步骤定义并验证最大保存时间。

问：2.11 您描述了评估原料药和 API 制造商污染风险的控制措施。据您所知，是否有对用于制造非无菌药品（干粉剂型）的 API 或原料生产设施进行环境监测的要求？

答：如果为生产定义了卫生区（hygiene zone），则必须满足该卫生区的要求。

问：3.1 是否要求或 FDA 期望在任一制造工艺步骤（如细胞培养）中进行厌氧微生物负荷检测？

答：是的，FDA 要求在哺乳动物细胞培养工艺结束时检测厌氧微生物负荷。

问：3.2 最终散装产品中是否使用了哺乳动物细胞培养培养基？

答：没有。在基于 CHO（中国仓鼠卵巢）的表达系统中，产品释放到上清液中。上清液被纯化。因此，细胞培养培养基不再存在于最终产品中。

问：3.3 “为微生物检测，预培养收获样品的推荐方法是过滤法还是 TSB 等液体培养基？”

答：取决于预收获样品的标准。如果定义为“不存在任何微生物污染”，则可使用定性方法，如直接接种法。如果定义了微生物负荷限度——例如 ≤ 10 CFU/10 mL——则必须使用定量方法。由于待检测体积的规定，仅薄膜过滤法适用。

问：3.4 “关于柱洗脱的预过滤样品。洗脱阶段通常在整个阶段并不恒定，通常在洗脱的第一部分洗脱出高浓度产品的主峰，而接近阶段结束时产品浓度降低。应取样哪个时刻，我们如何保证其代表整个阶段？”

答：应检测用于进一步加工的相应馏分中的微生物负荷。

问：4.1 (i) “EMA《药品、活性物质、辅料和初级容器灭菌指南》（2019 年 3 月 6 日）指出‘在大多数情况下，NMT 10 CFU/100 mL（TAMC）的限度对于微生物负荷检测是可接受的’。从您的角度看，这是否意味着 100 mL 代表待过滤的最小体积？您是否了解 FDA 对产品待过滤最小体积的期望？”

(ii) “小体积药物溶液灭菌前合理的微生物负荷限度是多少？指南建议 100 cfu/100 mL，但如果整批仅为一支 20 mL 小瓶，这意味着每支小瓶 2 cfu，几乎无菌。100 cfu/100 mL 没有意义，但其他哪些限度可被论证？”

(iii) “标准/可接受水平是 10 CFU/100 mL 吗？”

答：期望样品体积为 100 mL。对此样品体积的任何偏离都必须论证并获得主管卫生当局接受。通常，无法定义“最小”体积。始终是逐案考虑。

问：4.2 “对于终端灭菌产品，其制造工艺包含灭菌前的微生物负荷降低过滤步骤，应在工艺的何处取样 IPC 微生物负荷？过滤后（但灭菌前）检测微生物负荷可以吗？还是应在散装（过滤和灭菌前）检测微生物负荷？”

答：如果制剂制造工艺包含进一步的工艺步骤，可能需要额外的取样点。

问：4.3 (i) “分析 10 mL 样品（IPC 或 DS）时，您是将最终结果表示为 CFU/10 mL，还是允许外推至 100 mL 以符合 EMA《药品、活性物质、辅料和初级容器灭菌指南》（2019 年 3 月 6 日）？”

(ii) “标准 < 10 CFU/100 mL……如果我们只有 10 mL 待检测，那么我对 < 1 CFU/10 mL 的标准感到不适：微生物实验室进行的微生物负荷检测无法管理 < 1 的标准（设备、检测环境……）？”

(iii) “对于小批量，您同意将 10 mL（或 30 mL）样品上获得的结果外推至 100 mL。这是基于样品中微生物污染均匀的假设。然而，大多数时候，菌体在样品中是成簇分布的。因此您如何论证您的方法？”

(iv) “什么被视为低批量？最多 10 升？更多？”

答：您的内部检测方法必须定义报告方式。最终结果可表示为 CFU/10 mL，或在外推后表示为 CFU/100 mL。

问：4.4 (i) “您是否证明过用于产品灭菌的 0.2 微米过滤器对支原体的截留能力？”

(ii) “特别是您如何处理 USP<1229.17> 关于支原体灭菌的章节？还是您计划采用标准的 0.1 微米灭菌？”

(iii) “无菌过滤前微生物负荷：您是否真正检查支原体的不存在？”

答：是（对于 DS 工艺）和否（对于 DP 工艺）。通常，EMA 指南表 3 中总结的最终无菌过滤用过滤器要求（子节 4.1.5“无菌过滤”）以及质量申报资料中需提供的过滤器数据被采用。柔膜菌纲（Mollicutes）的不存在将在细胞培养/USP 工艺结束时证明，且无菌制造条件保证在 DSP（下游工艺）过程中不发生柔膜菌纲污染。（注：1000 以上的 USP 章节不具约束力，仅供参考。）

问：4.5 警戒水平 = 如何进行鉴定？总是通过 16S rDNA 测序？

答：是的。

问：4.6 附录 1：终端灭菌指出微生物负荷可被监测。因此并非强制。您在此主题上关于检查/授权的经验如何？这是转向逐批检测的原因，还是有其他原因？

答：EMA《药品、活性物质、辅料和初级容器灭菌指南》明确要求监测最终灭菌工艺前的微生物负荷。

问：4.7 如果最后一次微生物负荷样品应缺失（由于实验室错误或其他原因），这是否立即意味着批次拒收，或者历史数据能否挽救批次？还是最终产品的无菌检测？

答：原则上，微生物负荷结果缺失并不意味着批次必须拒收。公司有可能进行风险评估。如果晚期 IPC 样品的微生物负荷结果缺失——甚至无菌过滤步骤前的微生物负荷结果缺失——那么很可能极难基于风险评估放行批次。最终，在欧洲由 QP（质量受权人）决定，在其他国家由 QA 部门决定。

问：5.1 对无菌产品中间过程微生物负荷中回收的微生物（MO）进行风险评估是否为一种期望？

答：在批次放行过程中，必须调查每个污染事件，判断其是否可能对产品和/或患者安全产生影响，从而基于风险评估决定相关批次能否放行。

问：5.2 您是否认为风险评估文件的范围也包括对制造中间体或缓冲液（用于生物制药原料药制造）的中间过程控制微生物负荷检测？

答：是的。

问：5.3 (i) “如果微生物负荷检测缺失，您能否分享一些非微生物负荷程序的步骤。”

(ii) “当微生物负荷结果缺失时，您是否将此情况作为不符合的微生物负荷结果处理？”

答：微生物负荷结果缺失的调查是一项跨职能活动，包括 QC、QA 和制造部门。

• 第一步，必须确定微生物负荷结果缺失的原因，并定义 CAPA（纠正和预防措施）。

• 下一步是评估制造工艺去除污染和/或可能副产物的能力。

如果可获得，可考虑以下数据：

• 每种样品类型前后各工艺步骤的微生物负荷结果

• 针对相关样品类型的多批运行趋势分析和相关微生物负荷结果

• 相关样品类型之后首次执行该检测的工艺步骤的内毒素结果

• 提供相关样品类型的生产场地环境 QC 数据及所用水的数据评估。

问：5.4 无菌产品过滤前中间过程微生物负荷的预过滤检测是否需要患者安全和产品质量评估？

答：不需要——期望是如果超过微生物负荷限度，批次应被拒收。

问：5.5 对于超过警戒水平的微生物负荷鉴定，您鉴定到何种水平（总是到种水平，还是革兰氏特征）？

答：使用 16S rDNA 测序，因为对于微生物负荷超标的逐案评估，必须鉴定污染物以执行评估的后续步骤。

问：5.6 产品质量影响（PQI）计算。是否考虑微生物的倍增时间以及从取样到产品通过过滤器的时间来计算达到的理论微生物负荷水平？并且该数字是否用于 PQI 计算而非样品中的微生物负荷计数？

答：不，样品中的微生物负荷计数是相关值。

问：5.7 关键组分是理论上分析还是实际措施（与外部承包商一起）？

答：它是文献综述、实验研究（蛋白质组学研究）以及临床研究的结合。

问：5.8 建议进行哪些稳定性试验以论证不存在 PQI（产品质量影响）？

答：分析产品完整性的检测。

问：5.9 对于微生物负荷超标的评估，细菌 DNA 和细胞组分可能从所有细菌中潜在释放。这意味着对于这些组分，使用 IPC 中微生物的数量来计算风险（在这种情况下微生物鉴定无关紧要）？

答：对于鞭毛蛋白或细菌 DNA 等组分，我们使用通用值。然而，对于细胞壁组分，污染物是革兰氏阳性还是革兰氏阴性细菌会产生差异。污染物是否产生外毒素，如果是，产生哪些外毒素，只有在鉴定污染物后才能评估。

问：5.10 患者安全评估的关键文献来源/参考文献是什么？（注：向罗氏同事的明确提问）

答：一份重要文件是《化学物质毒性效应登记库》（RTECS®），《RTECS 综合指南》，D. V. Sweet 编，美国卫生与公众服务部，公共卫生服务，1997。

问：5.11 文献检索：您是否总能找到关于 PAMPs（病原相关分子模式）理论浓度的信息？

答：是的。

问：5.12 蛋白酶在 PQI 评估期间被评估，对吗？

答：是的。

问：5.13 如果报告的计数为 TNTC（无法计数），是否有任何最坏情况进行 PQI（产品质量影响）？

答：我们不使用微生物负荷超标的通用评估。检测方法必须能够量化达到行动限 10 倍以上的量。但理论上，您也可以进行计算/评估，假设您受到了 1000 CFU/mL 或 10,000 CFU/mL 最坏情况微生物的污染。该模型也适用于此类假设。

问：5.14 有关于蜡样芽孢杆菌（B. cereus）更强外毒素的文献，您如何确定蜡样芽孢杆菌为最坏情况？

答：据我们所知，肉毒毒素（由肉毒梭菌 Clostridium botulinum 产生）是最强的细菌毒素。其次是破伤风痉挛毒素和破伤风溶素（均来自破伤风梭菌 Clostridium tetani）。

问：5.15 如果细菌副产物的降低无法测量，我们不知道计算出的理论值是否在后续工艺步骤中降低。为何仅在不存在进一步降低步骤时才建议进行稳定性试验？

答：我们从工艺验证中得知，细胞组分（如宿主细胞 DNA、宿主细胞蛋白……）在下游工艺中被去除。然而，我们无法确切定义特定微生物组分的纯化率。因此，我们仅当最终纯化工艺步骤中微生物负荷值超过我们预定义的限度时才进行稳定性研究。

问：5.16 对每个组分分别计算风险是否安全？也许两种都诱导先天免疫反应的组分具有协同效应？还是这已被计算的最坏-最坏-最坏情况方面所涵盖？

答：对于每个组分，计算是“最坏-最坏-最坏”情况假设。因此，我们排除了协同效应。卫生当局也接受这一点。

问：6.1 对于应用于无菌产品的原料检测，是否无需检测这些原料中的有害生物（objectionable organisms）？

答：对于生物制药制造工艺，未规定有害生物。除非存在专论的直按物料（direct materials）。这些直接物料必须满足药典要求——这可能包括指定微生物的检测。

问：6.2 对于柔性袋等初级包装的微生物负荷检测，是否有必要进行提取效率试验并检测空包装的微生物负荷？还是可论证重要的是提取到产品中的微生物，且它们将在产品的微生物负荷检测中被检出（如果您对灌装产品在进行灭菌前检测微生物负荷）？

答：不要求对无菌一次性使用（disposable）物品进行检测。生产企业可接受供应商的证书（如果满足所有 GMP 要求，例如存在质量协议、已执行审计……）。

问：6.3 关于应用于起始物料的微生物计数试验的方法适用性试验。将微生物悬液加入产品溶液与溶液过滤之间的保存时间，是否应作为方法适用性试验（MST）的一部分进行量化？应将其归入最坏情况还是上限？

答：方法适用性试验应反映例行条件下的微生物负荷检测。方法适用性试验应根据相关药典通则执行，在加入接种微生物后不进行任何预孵育步骤。