TGA发布Pfizer与Moderna COVID-19 mRNA疫苗质量保证与控制检测结果

样本

本报告中 Comirnaty® 和 Spikevax™ mRNA COVID-19 疫苗的批放行检测发生于 2021 年 2 月 9 日至 2024 年 7 月 26 日期间（但这些产品的批放行仍在进行中）。本研究使用了不同批次和配方的 Comirnaty®（Pfizer Australia Pty Ltd）以及 Spikevax™ 多剂量瓶和预充式注射器（Moderna Australia Pty Ltd）的样本。样本按其批准的储存条件储存。

检测程序

表 2 列出了作为 TGA 批放行一部分用于检测 mRNA 疫苗的分析检测方法清单^19-22。由于部分检测方案属于商业机密，希望进行相同检测的研究人员应直接向各生产商索取完整的生产商检测方案。

* 这不是批放行所进行的检测。检测是在批次放行后对部分批次进行的。

RNA 鉴别 - RT-qPCR

为确认样品中存在正确的 RNA 种类，Comirnaty® 和 Spikevax™ 疫苗均使用序列特异性引物和探针通过 RT-qPCR 扩增进行检测。使用 QiAMP RNA Viral Mini 试剂盒（Qiagen，Hilden，Germany）按照生产商说明从样品中提取 RNA。反应使用 QuantStudio 3 RT-PCR 系统（Thermo Fisher Scientific，Massachusetts，U.S.）和市售一步法 RT-PCR 试剂盒进行。每次检测均使用无核酸酶水作为阴性对照，并使用原料药（DS）参考品作为阳性 PCR 对照。阴性提取对照使用经过 RNA 提取流程的无核酸酶水制备。在适用情况下，阳性提取对照使用疫苗制剂（DP）参考批次制备。所有样品和对照均使用产品特异性热循环条件进行三个技术重复检测，包括逆转录步骤及随后的多轮熔解和退火。所有检测重复中样品均获得扩增，且循环阈值（C_T）低于产品特异性 cut-off，从而确认 mRNA 序列一致性。检测适用性由对照表现确定：所有阳性对照品重复的 C_T 值均须低于 cut-off，所有阴性对照重复须无扩增或 C_T 值高于 cut-off 值。若三个重复均产生一致结果，则样品被接受。

RNA 一致性/比例 - RPIP-HPLC - Spikevax™

该检测确认二价疫苗配方中存在的两种 mRNA 种类的一致性及相对含量。为确认 Spikevax™ 二价产品中 RNA 的一致性和比例，样品使用 Waters Acquity H-Class 超高效液相色谱（UPLC）系统（Waters，USA）通过 RPIP-HPLC 进行检测。RNA 样品在去配方缓冲液中变性，以使用市售试剂盒（Zymo Research，USA）破坏 RNA 二级结构。RNA 通过离心柱使用洗涤缓冲液、无 RNase 水并以 15,000 x G 离心 1 分钟进行纯化。为进行消化，将制备的 RNA 样品与模板引导的 RNase H 消化混合物在 65°C 孵育 30 分钟，随后按照生产商说明加入预先配制的淬灭溶液和 DIEAA 溶液。所得 RNA 片段使用生产商推荐的梯度条件以 0.45 mL/min 的流速通过 RPIP-HPLC 分离。分离的 RNA 片段通过 260 nm 紫外吸收在线检测，并使用对应于已知 RNA 标准的峰确定 RNA 一致性。样品的 RNA 比例通过将样品 RNA 峰面积百分比与 RNA 产品标准常数的峰面积百分比进行比较来确定。接受标准设定为干扰百分比 ≤ 5%，参考标准 RNA 峰面积的相对标准偏差（RSD）百分比 ≤ 5%，参考标准 RNA 峰保留时间的 RSD 百分比 ≤ 5%，每个夹心标准峰面积相对于参考标准 RNA 峰平均峰面积的回收率百分比为 90 – 110%。

脂质含量 - HPLC-CAD

该检测确认组成 LNP 的四种脂质各自的正确类型和数量。

对于 Comirnaty®，使用配备电雾式检测器（CAD）（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州）的 Waters Acquity H-Class UPLC 系统（Waters，美国）对 ALC-0159、胆固醇、ALC-0315 和 DSPC 进行鉴别和定量。流动相由水性溶剂（例如水或缓冲溶液）与有机溶剂的组合构成，以尽量减少背景噪声并确保与 CAD 兼容。标准储备液使用醇溶液和脂质对照品配制，质控品则根据生产商说明用储备液稀释制备。DP 样品用甲醇稀释，以确保脂质浓度符合生产商规定的标准曲线范围。样品采用 HPLC-CAD 分析。样品可接受标准设定为 % RSD ≤ 10，以及每种脂质的 % 相对保留时间（RRT）符合生产商规定的可接受标准。

对于 Spikevax™，使用配备 CAD 检测器（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州）的 Waters Acquity H-Class UPLC 系统（Waters，美国）对 PEG 2000 DMG、胆固醇、SM-102 和 DSPC 进行鉴别和定量。流动相由水性溶剂（例如水或缓冲溶液）与有机溶剂的组合构成，以尽量减少背景噪声并确保与 CAD 兼容。标准储备液使用醇溶液和脂质对照品配制，质控品则根据生产商说明用储备液稀释制备。DP 样品用乙醇稀释，以确保脂质浓度符合生产商规定的标准曲线范围。样品采用 HPLC-CAD 分析。样品可接受标准设定为 % RSD ≤ 10，以及每种脂质的 % RRT 符合生产商规定的可接受标准。

mRNA 含量与包封率

对于 Comirnaty® 样品，为确认每个剂量中 mRNA 含量正确，使用 RiboGreen 荧光法（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州）结合 SpectraMax M5e 分光光度计系统（Molecular Devices，美国）对 LNP 中总 RNA 和包封 RNA 百分比进行定量。使用合格的 RNA DS 对照品，根据生产商说明以 DS mRNA 制备标准曲线。将含有包封 RNA 的 DP 样品与 DS 标准曲线进行比较，以测定游离 RNA（不加非离子表面活性剂）和总 RNA（加入非离子表面活性剂以从 LNP 中释放包封 RNA）的量。加入 RiboGreen 使其与 RNA 结合并产生荧光信号，通过测量该信号确定游离 RNA 和总 RNA 的量。包封 RNA 的量通过从总 RNA 中减去游离 RNA 含量计算，包封率以包封 RNA 与总 RNA 的比值表示，以百分比计。测定可接受标准包括每条标准曲线的最低拟合优度，以及每条标准曲线稀释液重复荧光测量的最大变异度。

对于Spikevax™样品，疫苗剂量中总mRNA的含量通过AEX-HPLC测定。游离（未包封）mRNA含量通过分光光度法测定，并按照制造商说明书用于确定Spikevax™疫苗样品的包封效率。包封mRNA通过AEX-HPLC测得的总mRNA（如下所述）与游离mRNA含量之间的差值计算。包封效率以包封mRNA与总mRNA含量的比值计算，以百分比表示。该测定涉及染料与疫苗测试样品中游离mRNA的络合以及相关吸光度变化的测量。疫苗测试样品按照制造商说明书制备至恒定浓度，并在用M5e分光光度计测量吸光度之前与储备溶液混合。基线吸光度使用与不含mRNA的疫苗制剂缓冲液混合的储备溶液测定。吸光度的变化与游离RNA含量成正比，其通过应用制造商提供的、与吸光度变化和RNA浓度相关的经验确定常数来计算。

RNA完整性 - 毛细管凝胶电泳

Comirnaty®疫苗的RNA完整性使用毛细管凝胶电泳（5300 Fragment Analyzer System，Agilent，加利福尼亚州，美国）评估。根据制造商规格，样品和参考物质通过与非离子表面活性剂和醇溶液孵育制备，以从LNP中释放RNA。释放的RNA在70°C变性2分钟，然后通过毛细管凝胶电泳分离。分析使用市售的Standard Sensitivity (SS) RNA试剂盒（DNF-471-1000，Agilent，加利福尼亚州，美国）进行。通过向毛细管阵列施加8 kV电压实现RNA按大小分离。在运行凝胶中加入荧光嵌入染料，使得RNA片段在通过连接到电荷耦合器件（CCD）检测器的LED光源前被检测到。RNA通过每根毛细管的迁移使用内标进行归一化，片段大小使用RNA ladder确定。样品以技术三重重复测试，空白作为阴性对照，参考物质DP作为阳性对照。RNA完整性报告为主峰面积占样品中总RNA的百分比。系统适用性和测定接受标准涉及评估RNA ladder和阳性对照的特异性和范围。

RNA纯度 - RPIP-HPLC

对于Spikevax™，单价和多价最终药品制剂中mRNA的纯度通过RPIP-HPLC在260 nm紫外检测下测定。该方法使用Waters Acquity H-Class UPLC系统（Waters，美国），通过流动相中的离子对试剂进行梯度洗脱，根据mRNA大小变异体的长度进行分离。纯度报告为主峰的相对面积百分比，主峰代表全长mRNA。

RNA含量 - AEX-HPLC

对于Spikevax™，最终药品样品中总RNA含量的定量使用AEX-HPLC在260 nm紫外检测下实现。使用Agilent 1260 Infinity II HPLC系统（Agilent Technologies，美国）。结果报告为制剂中总mRNA的浓度。

LNP 粒径与多分散性 - DLS

使用 DLS 和 Malvern Zetasizer Pro Blue（Malvern Panalytical，英国）对 Comirnaty® 和 Spikevax™ 疫苗的流体动力学粒径和多分散性指数 PDI 进行了分析。使用 NIST 可溯源纳米球粒径标准品（Thermo Fisher Scientific，美国）作为参考标准品，以确保粒径测量的准确性。所有操作均在生物安全柜中进行，以确保无尘环境。平均流体动力学直径和 PDI 由仪器软件计算。Comirnaty® 和 Spikevax™ 样品的参考标准品在测量前稀释至适当浓度。对于两种产品，系统适用性、测定和样品接受标准均通过标准品和/或样品测量的准确度和精密度来确定。

内毒素 - LAL

细菌内毒素检查按照欧洲药典 2.6.14 和美国药典 <85> 中规定的方法进行。

体外表达

采用基于细胞的体外表达（IVE）试验来确认 LNP 对细胞的转染以及 mRNA 序列翻译为刺突蛋白。HEK239T（人胚胎肾 239T 细胞）（ATCC，华盛顿特区，美国）按照 Pfizer 的检测方法与 Comirnaty® 和 Spikevax™ 产品一起孵育。每次试验均使用无核酸酶水和 DP 参考物质分别作为阴性和阳性对照。孵育后，收获细胞并用细胞活力染料染色，随后进行固定步骤。为检测刺突蛋白，将固定后的细胞与针对 SARS‑CoV‑2 刺突蛋白的特异性抗体孵育，随后与偶联藻红蛋白的二抗孵育。在 BD FACSCanto II（Becton Dickinson，新泽西州，美国）上检测免疫荧光细胞。测定接受标准由分析细胞数、活细胞百分比、技术重复的精密度以及对照结果确定。样品接受标准由单个、存活荧光细胞的百分比确定。

残留 DNA 含量监测

检测于 2023 年开始，使用 Comirnaty® 和 Spikevax™ 产品最近供应的两种 COVID-19 疫苗株（二价原始株 +BA.4-5 和单价 XBB1.5）的样品。检测按照欧洲药典 2.6.35 中所述的残留脱氧核糖核酸（DNA）定量标准检测程序进行。

统计分析

平均值以及标准差和变异系数百分比[（标准差/平均值）× 100]被用作主要分析方法，以评估检测结果内的变异性并评估批间一致性。