《中国药典》2025版通则1143细菌内毒素凝胶法双鲎试剂干扰试验示例

药典依据：《中国药典》2025版通则 1143 细菌内毒素检查法

适用场景：新品种首次建立细菌内毒素检查项；供试品处方、生产工艺变更；鲎试剂厂家 / 批号变更；试验环境发生可能影响结果的改变，需重新验证干扰试验。

基础信息

供试品原液浓度：c=5mg/mL
细菌内毒素限值：L=50EU/mg（不得过 50 EU/mg）

鲎试剂：博康海洋、安度斯，凝胶法，标示灵敏度均为λ=0.25 EU/mL
方法建立要求：两个厂家鲎试剂，应至少对 3 批代表性供试品分别完成整套干扰试验。
细菌内毒素工作标准品（CSE）：同一份标准品储备液，分别用于两家鲎试剂试验。
BET 水（内毒素检查用水）：凝胶法用，内毒素含量＜0.015 EU/mL，无内毒素干扰。
若供试品含有 β‑葡聚糖，会造成假阳性，可采用去 G 因子鲎试剂或 G 因子反应抑制剂消除干扰。
器皿：耐热玻璃器皿250°C干热灭菌≥30 min 除热原；一次性耗材采用无内毒素认证产品；全程严防外源内毒素污染，涡旋、移液操作轻柔，避免剧烈震荡。

核心计算公式

最大有效稀释倍数 MVD

水基质对照系列实测灵敏度 Es

3. 样品基质加标系列实测灵敏度 Et

✅ 稀释上限红线：最大允许稀释倍数 1000 倍，对应供试品浓度 0.005 mg/mL

✅ λ 合格区间：

核心试验规则

干扰预试验由高浓度（稀释倍数小）向低浓度（稀释倍数大）梯度开展；
找到第一个刚好无干扰浓度（该梯度 B‑预全部阳性，所有更高浓度 B‑预均阴性）；
取该点的下一个更稀梯度作为该鲎试剂的候选验证浓度，增加安全裕度；
博康海洋、安度斯两套体系完全独立开展预试验、独立正式试验、独立记录、独立计算 Es/Et；
对比两家候选验证浓度，取稀释倍数更大（浓度更低，更保守）作为统一正式干扰试验稀释倍数；不得超过 MVD；
边界特例：若刚好无干扰浓度已经等于 MVD（1000 倍），无更稀梯度，则直接使用 MVD 开展正式干扰，原始记录中注明该情况。

第二步：干扰预实验

预试验梯度（由浓→稀）

操作：博康海洋、安度斯分开两套，每个梯度全部重复下表；加样：0.1 mL 试液 + 0.1 mL 对应厂家鲎试剂；孵育条件：37°C±1°C，60 min±2 min。

预试验有效前提：A 预全阴、水阴性对照全阴、水阳性对照全阳；不满足则本梯度结果作废，重新试验。

示例预试验结果（方案举例）

博康海洋稀释 1、2、5、10、20 倍：B 预阴性（存在干扰）稀释 50 倍（0.1 mg/mL）：B 预全部阳性 →【博康刚好无干扰浓度】→取下一梯度：稀释 100 倍（0.05 mg/mL），博康候选验证浓度。
安度斯稀释 1、2、5、10、20、50、100 倍：B 预阴性（存在干扰）稀释 200 倍（0.025 mg/mL）：B 预全部阳性 →【安度斯刚好无干扰浓度】→取下一梯度：稀释 500 倍（0.01 mg/mL），安度斯候选验证浓度。

✅综合两家结果：统一正式干扰试验稀释倍数选择500 倍（0.01 mg/mL），500＜1000，不超过 MVD，符合药典要求。

第三步：正式干扰试验

本示例统一验证条件：稀释 500 倍，供试品工作浓度 0.01 mg/mL；

博康海洋、安度斯分别独立配制整套 3.3~4.4，两套独立记录，不可混用，应选用三批样品进行独立干扰试验。

3.3 供试品溶液稀释

备注：最终正式试验使用【稀释 500 倍供试液】，用于 3.5 配制 B 系列含供试品标准品。

3.4细菌内毒素标准品溶液制备

目标梯度：4λ、2λ、λ、0.5λ 储备液（λ=0.25 EU/mL，即 4λ=1.0 EU/mL、2λ=0.5 EU/mL、λ=0.25 EU/mL、0.5λ=0.125 EU/mL）

3.5 含供试品的标准品的制备

规则：用选定稀释倍数的供试液（500 倍）和标准储备液 1:1 混合，终浓度减半

500 倍供试液 300 μL + 4λ 标准溶液 300 μL → 2λ B 系列
500 倍供试液 300 μL + 2λ 标准溶液 300 μL → λ B 系列
500 倍供试液 300 μL + λ 标准溶液 300 μL → 0.5λ B 系列
500 倍供试液 300 μL + 0.5λ 标准溶液 300 μL → 0.25λ B 系列

C 系列（水基质对照）：BET 水替代供试液，和同浓度标准液 1:1 混合，得到 2λ、λ、0.5λ、0.25λ 水基质系列。

4 鲎试剂与样品混合、孵育和试验结果

4.1 鲎试剂与样品混合

博康海洋、安度斯分别复溶各自鲎试剂；按照说明书，加入 BET 水溶解，分装为 0.1 mL / 支；向各反应管分别加入对应 A/B/C/D 系列溶液 0.1 mL，等体积 0.1 mL 鲎试剂，轻柔混匀密封。

示例备注栏：鲎试剂标示灵敏度 0.25 EU/mL。

4.2 孵育

孵育温度：37°C±1°C，60 min±2 min；记录孵育起止时间。

4.3 试验结果

判读定义：轻轻取出各试管，缓慢倒置 180°，管内形成坚实凝胶、不变形、不从管壁滑脱为阳性（+）；未形成凝胶或凝胶松软滑脱为阴性（−）

终点判定示例（上表结果）：B 系列终点 =λ=0.25 EU/mL；C 系列终点 =λ=0.25 EU/mL

4.4 结果有效性判断

4.4.1 供试品 A 和阴性对照 D 所有平行管均为阴性：是

4.4.2 计算 C 系列（水基质）Es：

✅ Es=1.0λ，落在 0.5λ~2.0λ，C 系列有效

4.4.3 计算 B 系列（样品基质）Et：

Et=1.0λ，落在 0.5λ~2.0λ，B 系列无干扰

4.4.4 本次干扰试验通过：是

⚠重要：博康海洋、安度斯，必须分开做整套 4.3、4.4，独立记录 Es、Et，分别判定有效性与干扰结果，不能合并计算。

正式干扰试验完整接受条件（全部同时满足）

有效性前提
① A 组全部平行管阴性，D 阴性对照全部阴性；
② C 系列最高浓度 2λ 全部阳性，最低浓度 0.25λ 全部阴性；
③ C 系列实测在0.5～2λ之间；
干扰判定：B 系列实测在0.5～2λ(包括0.5λ和2λ)范围内，则该厂家鲎试剂在本稀释条件下无增强、无抑制干扰。
若其中一家不满足：需重新预试验，在≤MVD 条件下增大稀释倍数复测；或采取前处理消除干扰，并同步验证前处理不会破坏内毒素活性。

第四步：干扰消除手段（出现干扰时）

在不超过 MVD 前提下，进一步增大供试品稀释倍数，重复预试验 + 正式干扰；
样品 pH 偏离 6.0‑8.0：使用无内毒素酸、碱或缓冲液调节 pH；
其他前处理方式：中和、透析、滤膜过滤、适宜加热处理；

所有前处理方法必须做加标回收验证：将已知量内毒素加入供试品，经过和样品完全一致前处理后开展干扰试验，证明内毒素没有被破坏。

若样品含有 β‑葡聚糖，可选用去 G 因子鲎试剂或者添加 G 因子抑制剂，消除假阳性。

第五步：方法使用与变更控制

本方法验证通过后，日常检验可任选博康海洋、安度斯该规格鲎试剂；结果出现争议，按药典以凝胶限度试验结果为准；
变更触发重新验证条件：
更换鲎试剂厂家、批号；
供试品处方、生产工艺发生变更；
试验体系溶剂、缓冲液、前处理条件变更；
试验环境条件发生可能影响检验结果的改变。
若新增其他厂家鲎试剂，需要完整开展预试验 + 正式干扰试验验证。

📝结论

1、本品原液浓度 5 mg/mL，细菌内毒素限值不得过 50 EU/mg；

2、选用博康海洋、安度斯凝胶法鲎试剂，标示灵敏度 λ=0.25 EU/mL；经计算 MVD=1000。分别对两家鲎试剂开展梯度干扰预试验；博康海洋刚好无干扰浓度为 0.1 mg/mL（50 倍），候选验证浓度为 0.05 mg/mL（100 倍）；安度斯刚好无干扰浓度为 0.025 mg/mL（200 倍），候选验证浓度为 0.01 mg/mL（500 倍）。综合选取更保守的统一稀释倍数 500 倍（0.01 mg/mL，稀释倍数≤MVD）作为正式干扰验证条件。

3、在稀释 500 倍条件下，博康海洋、安度斯两套独立正式干扰试验：A 组、阴性对照 D 全部阴性；C 系列 Es=1.0λ，B 系列 Et=1.0λ，Es、Et 均落在 0.5λ‑2λ 范围内，供试品基质对两家鲎试剂均无增强、无抑制干扰。本品细菌内毒素凝胶法检查方法成立，供试品采用稀释 500 倍进行限度检查，日常检验可选用博康海洋或安度斯该规格鲎试剂。

个人经验梳理，仅供参考