中国药典 9251 指导原则公示稿解读，重组试剂条款拟扩为 rFC 与 rCR 两种方法

10 月 16 日，国家药典委公示 9251《细菌内毒素检查法应用指导原则》标准草案。这是 2025 年版药典之后，9251 的又一轮修订。

草案只修订"5. 其他"中的第（6）项：条款名由"重组 C 因子法"改为"使用重组试剂的细菌内毒素检查法"，下设重组 C 因子法（rFC）和重组级联试剂法（rCR）两种方法。

这次更名传递了两层信息。第一，条款定位从单一方法调整为方法族，标题与 USP 通则 <86> Bacterial Endotoxins Test Using Recombinant Reagents 直接对应，"重组级联试剂"的译名也沿用 USP 对 recombinant cascade reagent（RCR）的界定。术语层面的对齐，是本次修订最直接的与国际接轨动作。第二，rCR 首次进入中国药典体系。在正式药典通则层面收载 rCR 的，此前只有 USP。

9251 于 2020 年版首次收载，rFC 同版进入。其上游的细菌内毒素检查法（通则 1143）沿革更长：1993 年随《中国药典》1990 年版第二增补本首次收载，1995 年版二部附录收载修订版，2005 年版起历经多轮修订。2024 年 4 月和 7 月，9251 先后两次公示修订草案，修订成果进入 2025 年版。

01修订要点

修订说明为："依据国家药品标准提高制修订课题研究结论，修订正文'5. 其他（6）'条款，收载了重组级联试剂法。参照了美国药典、日本药典对该方法的定义、原理及操作方法进行界定，指导规范使用。"

修订说明点名 USP 和 JP，未提 EP。这符合国际现状：EP 2.6.32 仅收载 rFC，rCR 尚未进入欧洲药典。就 rCR 而言，中国药典可参照的实际上只有 USP 一家。

"补充方法"的定位值得细读。现行版第（6）条已经写明 rFC 是细菌内毒素检查法的补充方法、应符合凡例，本次的实质增量有两点：一是明确写入通则号 1143，凡例对通则方法的要求由此直接适用于重组试剂法，消除了此前未标通则号带来的执行歧义；二是将 rCR 纳入同一框架，两种重组方法在标准中的地位完全一致。

同时要区分"收载"与"放行替代"。药典收载一种方法，不等于允许以它替代各论规定的细菌内毒素检查法用于产品放行。USP 通则 6.30 将这类替代界定为 alternative method，方法适用性由使用方证明；EP 5.1.10 对 rFC 的使用前提作了同样的安排。公示稿延续的正是这一逻辑。

两条技术路线，取舍在级联深度

rCR 重建了 LAL 级联中的三个酶原：C 因子、B 因子、凝固酶原。内毒素激活 C 因子后级联逐级活化，最终由凝固酶切割显色底物释放呈色团，以动态显色法读出。三级酶促级联保留了与 LAL 相当的信号放大能力；产物吸收在可见区，常规动态显色酶标仪即可完成检测，多数实验室不需要新增设备。

rFC 只保留级联的第一环。C 因子被内毒素活化后直接切割荧光底物，于孵育终止时读取荧光值，属终点荧光法，激发/发射波长一般为 380/440 nm，检测温度 37℃±1℃，需配置荧光酶标仪。

两种方法的差异不在灵敏度高低，而在级联深度带来的方法学性格。rCR 保留了放大环节，动态曲线提供完整的反应动力学信息，与现有光度测定法的数据形态最为接近；rFC 将反应路径压缩到内毒素识别一步，受级联其他环节干扰的可能性最小。EP 只收载 rFC，USP 将两者并列收载，两个官方文本对级联深度给出了不同答案。ChP 同时收载两种方法，兼容了两个方向。

G 因子旁路常被误读。LAL 中的 G 因子对 β-葡聚糖起反应，是凝胶法和光度法假阳性的经典来源。有资料将"可能交叉反应"视为 rCR 的不足，这是把 LAL 的特性误归于重组试剂。rFC 与 rCR 均未重建 G 因子，USP <86> 明确指出重组试剂不受该假阳性途径影响，公示稿对两法均写明"不存在 G 因子旁路干扰"，表述与 USP 一致。

rFC 附文里还有一句容易被忽略：试剂不含 B 因子、凝固酶原、凝固蛋白原，对上述物质有抑制或增强作用的样品，适合使用重组 C 因子法。这为 rFC 在特定基质干扰条件下提供了独立的适用理由。该句 2025 年版已有，公示稿保留。

一个细节：rFC 附文末句缺失

现行版 rFC 附文末尾为"标准曲线的可靠性试验、干扰试验、检查法以及结果判断参照……（通则 1143）中的光度检测技术"，公示稿对应位置没有这一句；而新写的 rCR 段落反而明确"仪器要求和试验操作参照……光度检测技术"。1143 收载凝胶限度、凝胶定量和四种光度检测技术，不含荧光法，rFC 作为终点荧光法，与 1143 的技术衔接原本只靠这一句。末句缺失后，rFC 的标准曲线、干扰试验和结果判断出现技术依据空档。

公示稿声明仅涉及第（6）项。这处属于编辑处理还是另有考虑，待正式文本确认。

02国外药典

USP 是目前收载范围最广、推进最快的文本。通则 <86> 于 2024 年 11 月发布并开放提前采用，2025 年 5 月 1 日正式生效，同时收载 rFC 和 rCR。它的特点是把方法学判据写入通则正文：每批试剂建立标准曲线，至少 3 个浓度、每浓度 2 个重复，相关系数绝对值不低于 0.980；干扰试验按溶液 A（供试品）、B（加标供试品）、C（标准曲线系列）、D（BET 用水）的体系设计；加标回收率应为 50% 至 200%。判据前移到通则层面，压缩了方法转移中的自由裁量空间。

有一点值得对照：<85> 光度测定法要求每个标准浓度至少 3 个重复，<86> 为 2 个。在复孔数上，<86> 的要求比 <85> 低。

2026 年 9 月，USP 又将 <86> 写入七个制药用水专论：注射用水、无菌注射用水、抑菌注射用水、无菌吸入用水、无菌冲洗用水、纯蒸汽、血液透析用水，2027 年 4 月 1 日实施。内毒素限度没有变化，变化的是方法地位：<86> 被各论引用之后，对这些品种而言，它不再是一般意义上的替代方法。使用者仍需按 <1226> 完成方法确认，审核供应商验证资料，并用本地水样完成适用性试验；监管机构还可能要求提供与 <85> 的比对数据。

EP 只收载 rFC。2.6.32 收载于增补本 10.3，2020 年 7 月发布，2021 年 1 月 1 日生效，配套修订的 5.1.10 给出了使用 rFC 的前提条件。2024 年 4 月，纯化水（0008）和注射用水（0169）修订版实施，直接允许按 2.6.32 检测，无需再与 2.6.14 做平行比对。rCR 目前尚未进入 EP，EDQM 官网未见相关立项公告。

JP 18 的 G4-4-180 属参考信息，题为"使用基因重组蛋白作为细菌内毒素试验和检测试剂替代的方法"，不构成强制要求。本次修订说明参照日本药典，参照的主要是定义和表述层面。

还有一层背景值得了解。1143 本身已通过 ICH Q4B 附录 14 与 USP <85>、EP 2.6.14、JP 4.01 实现协调，传统 BET 在三本药典间的差异已经很小。重组试剂不在 Q4B 协调范围内，各药典自行表态，这一领域的差异也就明显大于传统方法。ChP 本次修订选择 USP 的路径，是在这个尚未协调的领域里先行单边靠拢。

03这次修订的意义

最直接的是设备门槛。现行版只收 rFC，荧光酶标仪限制了部分实验室的采用；rCR 用常规动态显色酶标仪即可运行，从 LAL 光度法迁移时设备投入为零，方法切换的主要成本从硬件转为方法学验证。

第二是鲎资源与供应链。LAL 原料依赖鲎血，中国鲎已于 2021 年列入国家二级保护水生野生动物，美洲鲎的捕捞配额也在收紧；试剂供应同时高度集中，一旦中断，影响的是整条无菌放行链。重组试剂同时降低资源压力和单一来源风险。

第三是注册路径。两种方法收进同一个通则，与 USP <86> 的结构一致，中美双报时方法学表述可以直接对应。若本稿落地，ChP 将是继 USP 之后第二个正式收载 rCR 的主要药典；在此之前，rCR 的正式药典依据只有 <86> 一处，出口欧洲市场的产品使用 rCR 仍须按替代方法处理。

USP 和 EP 真正的共同点在制药用水。EP 2024 年 4 月放行纯化水和注射用水，USP 2027 年 4 月放行七个制药用水专论。制药用水基质简单、检测频次高、方法迁移风险最低，是重组试剂放行应用最合理的切入点。ChP 尚未走到这一步：9251 只到指导原则层面，注射用水、纯化水各论未见同步修订。即便本稿落地，在国内制药用水系统上使用 rFC 或 rCR，仍须按补充方法完成举证。这是目前与国外最实际的差距。

慢不等于松。专家学者对 ChP 与 ICH Q4B 协调文本的比较，ChP 在几处保留了更严的要求：检查用水的内毒素限度明确规定，凝胶法 0.015 EU/mL、光度法 0.005 EU/mL；凝胶法限度试验复试要求 4 管供试品全部呈阴性，ICH 为 2 管。这两条是有意从严。内毒素限值计算采用 60 kg 体重基准（USP、EP 为 70 kg），源自人群参数差异，同一给药剂量下折算的限值也更低。

04最后

鲎的捕捞配额在收紧，3R 原则在推进，LAL 供应链的集中度风险客观存在。内毒素检测的去动物源化，剩下的主要是节奏问题。

ChP 将 rCR 写入 9251，与 USP 的结构趋于一致：两种重组方法并存，rCR 照顾现有设备与流程，rFC 提供更短的信号通路。药典收载与放行替代之间的距离，公示稿没有消除；EP 和 USP 都是从制药用水各论先解决这个问题的，ChP 尚未走到。