121℃、30分钟灭菌常选D值2分钟BI的算法依据：D值与菌量如何对应12分钟致死量

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D值1.5分钟的BI能不能用？2分钟有没有特殊依据？3分钟是否更保险？选BI既要看原来有多少孢子、孢子有多耐热，也要看试验怎样判断结果，以及这些结果能证明多大的杀灭能力。

讨论湿热灭菌验证，常会遇到一个问题：同样是嗜热脂肪地芽孢杆菌，为什么有的方案接受D值1.5分钟，有的偏向2分钟，还有的直接采购更高耐热性的BI？

中国药典2025年版四部通则9207列出的商品化湿热BI典型特征，是121℃下D值1.5～3.0分钟、芽孢数1.0×10⁵～5.0×10⁶。这个范围帮助我们认识商品BI，并没有替每个灭菌程序完成选型。[1]

D值表示：在规定条件下，使活菌数减少90%所需的时间。每减少90%，就称为降低1个对数。例如100万个活孢子减少1个对数后，还剩10万个。

BI选型需要回答的是：已知一支BI的菌量和耐热性，用什么方法判断灭菌结果，才能证明程序达到了事先确定的杀灭目标。

本文看点

01

先把三个数分开：30分钟、12分钟、12D

02

D值2分钟的依据，来自“菌量与判定方法”的配合

03

D值1.5分钟能用，关键是补上对应的证明方法

01

CONCEPTS

先把三个数分开：30分钟、12分钟、12D

“121℃、30分钟”是程序描述。它是否对应冷点F₀约30分钟，要由负载实际温度曲线确认。

F₀采用121.1℃参考温度、z＝10℃。若某位置恰好维持121.0℃达30分钟，仅这一保持段贡献的F₀约为29.3分钟；升温、降温阶段还可能贡献致死量。因此，完整周期F₀是否超过30分钟，要积分计算，不能从程序名称直接判断。

“F≥12分钟”则是某些过度杀灭设计采用的最低致死量。PDA TR61针对SIP过度杀灭应用，要求确认物理致死量Fphys和生物致死量Fbio均达到至少12分钟。这是该技术报告特定设计策略的判据，应结合灭菌对象和适用依据使用。[2]

“12D”表示降低12个对数。D值为1分钟时，12D相当于12分钟；D值为2分钟时，12D相当于24分钟。12分钟与12D只有在相应D值为1分钟时才数值对应。

由此可见，讨论D值2分钟的BI为什么合适，不能只用“30÷2＝15D”回答。这个计算描述理论杀灭能力，还没有说明BI培养后全部无生长的试验结果能支持什么验证结论。

02

CHALLENGE

D值2分钟的依据，来自“菌量与判定方法”的配合

先明确试验怎样判断结果。常规BI挑战通常看灭菌后培养是否出现生长；做定量研究时，还会测定或估计剩余活孢子数。只看“长不长菌”和测出“还剩多少活孢子”，能提供的信息不同。

下面的计算采用对数线性模型，也就是假设每经过一个D值对应的时间，活孢子数再减少90%：

Fbio＝Dₜ×SLR

SLR＝lgN₀－lgNꜰ

N₀是灭菌前的芽孢数，Nꜰ是灭菌后的平均存活芽孢数，SLR表示减少了多少个对数。物理计算和BI参数要使用相同的参考温度及z值；基准不同时，需要先正确换算。

TR61的算例将菌量10⁶的BI完全灭活，按6个对数的降低量计算相应的生物致死量。其计算以灭菌后平均存活数Nꜰ＝1作为边界：从10⁶降至1，正好减少6个对数。若D值为2.0分钟，便有：

Fbio＝2.0×6＝12.0分钟

这正是TR61“Microbial Challenge”实例1的计算。TR1也给出类似算例：D值2.1分钟，为证明Fbio≥12分钟，反算需要完全灭活的最低挑战菌量约为5.2×10⁵。[2][3]

CDE指导原则附件2采用相同关系：lgN₀＝F₍T,z₎÷Dₜ＋lgNₜ。为计算应接种多少芽孢，指南通常将灭菌后存活数取为Nₜ＝1，即lgNₜ＝0。这是接种量设计所采用的计算值，并不表示培养试验真的测出了1个活孢子。[4]

所以，D值约2分钟、菌量约10⁶，配合“BI全部培养无生长”的结果，可以按报告的方法支持Fbio至少12分钟的验证目标。这一选择有技术计算依据，但不能写成法规统一要求所有121℃程序必须使用D＝2.0的BI。

需要区分“按报告方法进行验证判断”和“精确测出实际杀灭量”。有限数量BI全部培养无生长，只表示在试验条件下未检出存活，不能据此精确测得实际Fbio＝12分钟。实际致死量可能更高，也不能仅凭这一结果直接测出产品SAL，也就是无菌保证水平。

03

METHOD

D值1.5分钟能用，关键是补上对应的证明方法

仍以每支BI含10⁶个芽孢、灭菌后培养全部无生长为例，按上述方法计算：

这张表比较的是：同样观察到BI全部无生长，不同D值能按报告方法支持多大的生物致死量。它没有给BI划分合规等级，也不表示D＝1.5的BI不能用于过度杀灭程序。

TR61实例2讨论了D＝1.5分钟、菌量10⁶的情况：把最低可接受生产周期的暴露时间缩短至75%，完成BI完全灭活，再按报告方法推算完整周期的生物致死量。部分周期按9分钟计算，换算到完整周期后为12分钟。[2]

暴露时间因子＝（1.5×6）÷12＝0.75

完整周期Fbio＝9÷0.75＝12分钟

采用这一方法，要先证明缩短暴露的试验能够代表完整周期的杀灭过程。不能只把程序面板上的30分钟改成22.5分钟，就直接按比例推算；还要研究负载温度、排气、蒸汽穿透，以及升降温阶段对致死量的贡献。

也可以调整初始菌量，或采用适当的定量研究。若计算时取Nꜰ＝1，D＝1.5分钟要对应12分钟，就需要N₀＝10⁸。这个菌量超出了药典表中所列商品湿热BI的典型范围，通常不能直接从常规商品BI中选到。[1][4]

D＝1.5可以使用，但方案必须说明如何证明它达到了事先确定的验证目标。只把它放进30分钟完整循环，观察到全部无生长，再根据物理F₀计算出理论杀灭量，并没有增加独立的生物学测量证据。

04

RESISTANCE

D值3分钟更耐热，也要解释它适合挑战什么

D＝3.0分钟、菌量10⁶，灭菌后培养全部无生长，按报告方法对应18分钟的生物致死量。若某工艺仅以12分钟为最低设计要求，这支BI提出了更高的杀灭要求；方案中应说明选择理由，并确认实际程序有能力完成这一挑战。

但不能据此写成“D＝3.0在121℃、30分钟的程序里很容易长菌”，也不能把它的阳性直接叫作“假失败”。

假设BI位置确实获得30分钟等效致死量，且计算基准和湿热条件适用，模型预测的降低量是30÷3＝10个对数。对初始10⁶芽孢，对应的每支平均存活数为10⁻⁴。它与“只获得12～18分钟致死量”的情形有明显差别。

药典表中13.5～32.0分钟的杀灭时间范围，也不能直接作为某批D＝3.0的BI在实际灭菌柜内必需暴露32分钟的结论。批次性能、测试条件和实际负载暴露需要分别核实。[1]

一旦正式验证使用的BI出现有效阳性，应调查其身份、菌量与耐热性、培养条件、放置位置，以及实际排气和蒸汽穿透情况；若物理参数也偏离已验证范围，更应评估过程和负载影响。Annex 1要求调查失败或偏离已验证条件的灭菌过程。[5]

选较高D值可以形成更强挑战，却不能代替对过程的理解；出现阳性后换成较低D值再试到通过，同样不能解决原来的问题。

05

CORRELATION

物理与生物“等效”，怎样做得更扎实

常规验证中，物理确认与BI挑战要同时支持预设接受标准。CDE指导原则明确提出，两类结果应一致且不能相互替代。[4]

如果还要定量研究两者是否吻合，TR1 §4.4.1.6提出：当BI的Fbio可测量时，同位置测得的Fphys与Fbio应相等。这里包含实际测量和模型的不确定性，需要用合理的试验设计评价一致性，不能只要求两个报表数值机械相同。[3]

可以在开发阶段设计缩短暴露的试验，将BI布置在具有代表性的困难位置，并在邻近位置测温；必要时采用平行对照件，避免探头改变蒸汽穿透。通过适用的计数或生长／不生长数据分析获得SLR，再计算Fbio，与根据温度曲线计算的F值比较。

生长／不生长数据的统计分析有重复性前提。TR1 §3.1.1.2明确指出，散布在生产灭菌器不同位置的BI，不能默认视为接受相同致死量的重复样本，也不能简单汇总阳性比例来测定D值或评估杀灭；D值定值研究通常使用抗力仪保证暴露一致性。[3]

TR1有两个重要限定。第一，为协调物理与生物F值，应使用BI系统的实际z值计算相应的物理F值，不能不加说明地把所有物理积分都固定成z＝10℃。第二，常规强灭菌循环使BI全部阴性后，通常无法精确测得其实际Fbio；TR1也承认，这种一致性研究尚无统一标准方法，许多成功周期未单独开展此项研究。[3]

报告举例：D＝2.5分钟、N₀＝3×10⁶，将平均存活数降至10⁻²，对应F约21.2分钟。若根据温度曲线计算的F值接近21.2分钟，而充分设计的试验中BI阳性比例明显偏高，应研究蒸汽传递、位置或模型参数是否存在问题。10⁻²～10⁻³是报告提出的灵敏度与预期阴性概率之间的平衡区间，不等于少量BI全部阴性就能准确估计这个存活水平。[3]

这类研究有助于解释：测得的温度曲线，是否真实代表BI所经历的湿热杀灭条件。Annex 1本身没有规定Fphys必须在数值上等于Fbio，而是要求以物理测量及适当的BI支持验证，且不能用孤立的BI结果推翻其他关键参数和过程设计。[5]

06

SELECTION

现场选型，最终要落在这几项依据上

先明确程序至少需要提供多大的致死量、灭菌什么物品、采用什么验证方法，再选择BI的菌种、菌量、D值和使用形式，并说明怎样根据试验结果判断是否达到目标。

CDE注射剂指导原则对过度杀灭法提出，通常采用嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢，或其他D₁₂₁℃大于1分钟的芽孢。它没有规定必须使用D＝2.0的BI；这一菌种与耐热性条件，还需要与后续挑战设计共同评价。[4]

如果采用TR61算例的方法，以BI完全灭活支持Fbio≥12分钟的验证目标，D约2分钟、菌量约10⁶是方便的选择。D在2.0～2.5分钟之间也可能适用，但需要满足前述假设，不能推广为所有121℃、30分钟程序的统一采购标准。

确认时应使用该批BI的菌量和D值一起计算。例如N₀＝1.5×10⁶，lgN₀约6.18，D＝2.0分钟，按上述“全部无生长”的判定方法计算，约对应12.35分钟。选型时还应考虑批次参数的变化并留出余量，不能只用标称值凑出恰好12分钟。

还要确认BI的实际使用方式适合负载。BI耐热性会受介质、载体和包装影响；供应商在标准条件下测得的数据，是否适用于现场的使用形式，需要论证。芽孢悬液用于液体物品灭菌时，药典要求测定其在被灭菌液体中的芽孢数和D值。[1]

供应商合格、运输储存受控、培养与回收条件适用，也是选型的一部分。Annex 1 §8.43要求新批BI使用前核实菌量、纯度和菌种身份；D值、z值等关键参数通常可使用合格供应商的批次证书，并非要求每批都在生产灭菌柜内重新测定抗力。[5]

评价一支BI，要看它是否适合实际工艺、负载和验证方法。D值2分钟之所以常见，是因为在某些验证方法下，菌量10⁶的BI全部培养无生长，可以支持12分钟生物致死量的判断。D值1.5或3.0也有适用场景，方案需要写清选择理由、怎样开展试验，以及试验结果能支持什么结论。

07

REFERENCES

参考依据

［1］《中国药典》2025年版四部，通则9207《灭菌用生物指示剂指导原则》：商品BI典型特征、应用要求，以及芽孢悬液用于液体物品灭菌的要求。

［2］PDA Technical Report No. 61（2013），Steam In Place：过度杀灭设计及Microbial Challenge实例1～3。本文引用其SIP确认方法讨论选型逻辑；用于灭菌柜时，应另行论证负载、蒸汽传递和验证方法的适用性。

［3］PDA Technical Report No. 1，Revised 2007：§3.1.2，§4.4.1.6，§5.2工艺确认算例及§5.2.2。PDA技术报告为行业技术参考，不等同于法规条文。

［4］《化学药品注射剂灭菌和无菌工艺研究及验证指导原则（试行）》：湿热灭菌物理确认、生物学确认及附件2。适用对象为化学药品注射剂，不宜将其全部条件无差别推广至所有物品灭菌。

［5］EU GMP Annex 1（2022），§§8.36、8.41～8.43、8.51～8.52、8.59。欧盟委员会原文。

END

我是药事良言，致力于制药法规知识分享。

你们的BI选型方案，是否写清了每支BI原来有多少孢子、灭菌后用什么结果判定合格，以及怎样据此判断程序的杀灭能力？欢迎留言交流。