国家药典委《药品污染菌耐受性检查指导原则》公示稿技术解读，征求意见至2027年1月14日
2027年1月14日公示截止｜药典新增《药品污染菌耐受性检查指导原则》
国家药典委于2026年10月16日发布《药品污染菌耐受性检查指导原则》公示稿，属新增制定，征求意见期90天，至2027年1月14日截止。公示稿设非无菌概率不高于10⁻⁶的门槛，并给出芽孢筛查、沸水浴耐热性评估与D值测定三级方法，其中把初始芽孢数写入公式的沸水浴法为中方新增。起草说明称具体测定方法此前仅美国药典通则〈56〉收载，欧洲药典只提出生物负荷耐热性表征要求而未提供方法。
材料把公示稿的三级方法路径与USP〈56〉、欧洲药典的相关要求逐项对照，可帮助读者看清新增内容与既有方法的分工。
提示 本文所称公示稿，指国家药典委 2026-10-16 发布的第 1 次征求意见文本，尚未定稿，引用请以药典委官网原文为准。本文为技术解读，不构成执行依据。 |
一、公示概况：新增制定，非修订
2026 年 10 月 16 日，国家药典委员会官网发布新公示（编号 Fg2026-0059，业务编号 通辅包20260058），拟制定《药品污染菌耐受性检查指导原则》，公示期 90 天，至 2027 年 1 月 14 日截止。
这份文件是新增制定，不是修订。中国药典微生物通则体系中，9208 确定生物指示剂的耐受性检查方法，1105／1106 确定计数与控制菌检查方法，唯独产品分离污染菌的耐受性测定此前没有对应的方法标准，本次制定即填补这一空白。
牵头单位为中国食品药品检定研究院，参与单位 12 家：上海市药品检验研究院、浙江省食品药品检验研究院、广西壮族自治区药品检验研究院、四川省药品检验研究院、陕西省药品检验研究院、宁夏回族自治区药品检验研究院、新疆维吾尔自治区药品检验研究院等 7 家省级／自治区级药检机构，广州市药品检验所、苏州市药品检验检测研究中心 2 家市级机构，以及苏州百特、费森尤斯卡比华瑞、四川科伦 3 家最终灭菌注射剂企业。
参与单位的构成直接指向应用场景：三家参与企业均生产大容量／小容量注射剂的终端灭菌产品，百特与费森尤斯华瑞的产品线还涉及 BFS 与软袋。这份指导原则主要服务于低 F0 工艺、依生物负荷设计和参数放行几类生产形态，也是近年注册发补和现场检查中最常被追问"耐热性研究怎么做"的环节。
二、公示稿解读
正文篇幅不长，结构紧凑，可以概括为"一个门槛 + 三个方法"。
2.1 门槛：PNSU ≤ 10-6
公示稿开篇先交代通行的表述：无菌物品是指物品中不含任何活的微生物，其无菌特性"一般通过物品中活微生物的概率来表述"，即非无菌概率（PNSU）或无菌保证水平（SAL）；并明确经最终灭菌工艺处理的无菌物品，PNSU 不得高于 10-6。湿热灭菌被灭物品的PNSU由以下公式计算：
lg NF = lg N0 − F(T,Z) / DT
NF：灭菌后微生物数量；N0：灭菌前微生物数量；F(T,Z)：等效灭菌时间；DT：微生物在温度 T 下的耐受性
公式中的三个量，N0 有生物负荷监测和 1105 计数支撑，F 有温度压力曲线和 F0 追踪，唯独 DT 此前没有药典方法。公示稿明确适用范围"主要用于指导湿热灭菌物品中的污染菌的耐受性检查"，同时写明"其它灭菌或除菌方法亦应关注微生物的耐受性并开展相关研究和评估工作"。后一句意味着本文件只解决湿热，其他灭菌方式的耐受性研究仍属企业自主评估范畴。
2.2 三个方法：从"有没有"到"是多少"
方法 | 性质 | 关键条件与判定（公示稿原文） |
芽孢筛查 | 定性 | 供试液（液体品可直接用原液）70℃ 加热 30 min 后迅速冷却，薄膜过滤或直接接种（接种量不超过培养基总体积 10%），TSA／TSB，30～35℃ 培养 5～7 天；有菌生长则分离纯化并做适当水平鉴定，判为含芽孢细菌的进入下一步 |
沸水浴耐热性评估 | 半定量 | 95～100℃ 系列时间处理后培养，按阳性结果最长时间估算 D121℃；法一查表 1（10～100 min → ≥0.1～≥1.0 min），法二用公式(2)或查表 2 |
D 值测定 | 定量 | 照指导原则 9208 的阴性分数法或残存曲线法；"通常可以选择低于 121℃ 的温度" |
三者的差别在成本与精度：芽孢筛查只需一台水浴锅和常规培养基；沸水浴评估仍是水浴锅，但要增加时间点和培养天数；9208 的 D 值测定需要抗力仪或油浴。公示稿允许"根据实际情况选择上述一种或多种方法"，实际执行即分级递进：先筛查芽孢，再决定是否进入定量测定。
两处通用要求容易被忽略。一是抑菌性处理：芽孢筛查与沸水浴评估前都要考虑样品抗菌活性，必要时照 1105、1106 做方法适用性试验，用枯草芽孢杆菌 CMCC(B)63501 或其它耐热芽孢，芽孢悬液照 9210 制备。二是方法弹性："也可使用其它经确认的热处理和培养方法"，为自动化仪器和替代方法留了接口。
2.3 法二：公示稿的主要增量
起草说明明确指出：法一"与美国药典通则 56 收载的方法一致"，法二为中方新增。法一的查表估算未把初始芽孢数量纳入，10 min 阳性即给 ≥0.1。N0 较小时影响有限；N0 增大后，同样的存活信号对应的真实 D 值会明显偏小。法二将初始芽孢数显式写入公式：
D121℃估计 = t / {[lg N0 − lg(ln(M总/M阴))] × 102.1}
t：沸水浴时间；N0：每管初始芽孢数；M总、M阴：处理总管数与阴性管数（一般取 M阴=1）
公式包含两个经典统计构件：lg(ln(M总/M阴)) 是 Halvorson–Ziegler 阴性管点估计，6 管中 1 管阴性时每管平均存活数即 ln 6 ≈ 1.79；102.1 是 z=10℃ 假设下 100℃ 到 121℃ 的致死率换算因子（10(121−100)/10 ≈ 125.9）。法二实质是阴性分数法与温度换算的结合，与 9208 阴性分数法同源，以沸水浴替代梯度灭菌，设备要求大幅降低。
对表 2 验算：三列数值在 N0 取 10、102、103，M总=6、M阴=1 时与公式严格吻合，t=10 min 得 0.106、0.0455、0.0289，对应表中 ≥0.11、≥0.045、≥0.029。正文取值规则为"N0 取表中芽孢数量的十分之一"，映射到三列即各列下限的十分之一。这是为保证 D 值高估而设置的保守偏置（N0 取小则 D 偏大，工艺冗余更足），但文中未写明这层对应关系，使用者若以实测 N0 直接查表，结果会不同。
法一与法二的分工，起草说明用试验数据给出了结论：N0＜103 cfu 时两法结果一致（t/94 与 t/100 差异很小），N0≥103 cfu 时法二更准确。估计值能否当真实值用，公示稿自己有交代：法一"一般情况下，该方法得到的 D121℃ 值高于其实际值"，属给工艺留冗余的安全侧设计。
三、国外药典对照：USP 有方法，EP 只有要求
起草说明中"具体方法仅有美国药典 2025 年第 3 版通则 56 收载"一句，界定了这份文件的定位。具体对照如下。
3.1 USP〈56〉：方法学的唯一直接对标
USP〈56〉全称 Methods for Determination of Resistance of Microorganisms to Sterilization Processes，官方生效日 2022 年 8 月 1 日，现行版本收录于 USP-NF。章节结构分四块：样品制备、芽孢有无检查（适用于除过滤和辐照外的所有灭菌方式）、耐热性估计（仅湿热）、D 值测定（仅湿热）。引言中有一句关键的方法学表述：各方法按"稳健性递增"的顺序排列（in order of increasing robustness），这正是公示稿三段式结构的出处。
USP 的具体条文比公示稿细得多，几处关键条件：水溶液样品从密闭初级容器取 10 mL，至少 10 个样品；芽孢有无检查用 70～75℃ 加热 30 min，冷却到 30～35℃ 后加入钙-吡啶二羧酸（Ca-DPA）60 mM 与十二烷基胺 1.2 mM，维持 30 min 再计数，培养基同样含这两种促萌发剂，30～35℃ 培养 5～7 天；D 值测定里，>110℃ 的工艺照〈55〉用饱和蒸汽抗力仪，≤110℃ 可改用水浴等装置适配，试验规模为 20 个重复样品 × 不少于 5 个暴露条件＝100 次试验，相邻时间间隔不超过预期 D 值的 75%，灭菌后须在 4 h 内回收，观察 7 天，计算可用有限 Spearman-Karber 法、残存曲线法或 Stumbo-Murphy-Cochran 法。
另外，USP〈1229.3〉提到，不可辐照的致死性工艺可用 100℃ 热激筛除营养体并促使芽孢萌发；〈1229.2〉把沸水试验作为生物负荷耐受性的基础筛查手段。公示稿的芽孢筛查与沸水浴，与这两条是同一思路。
3.2 EP 与欧盟：有要求，没方法
欧洲药典没有对应通则，"生物负荷耐热性"的要求散在三处。
文件 | 与污染菌耐受性直接相关的要求 |
Ph. Eur. 5.1.1 | 参考工艺为终端湿热灭菌 ≥121℃ / ≥15 min；F₀>8 min 的替代工艺中，>115℃ 与 >110℃ 档位均标注 "Bioburden Characterised: Yes"，即需对生物负荷进行表征 |
EMA 灭菌指南 | >115℃ 且生物负荷已表征的工艺，需有"工艺过程控制证明生物负荷耐热性可接受"；除菌过滤后终端热处理（>110℃）需在灭菌（过滤）步骤前对生物负荷进行耐热性表征 |
Ph. Eur. 5.1.2 | 湿热 BI：嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus），D121℃ ≥ 1.5 min，>5×105 孢子/载体；121±1℃ 6 min 需有存活、15 min 应无生长 |
欧盟监管提出了生物负荷耐热性表征的要求，但未提供测定方法，行业此前只能引 USP〈56〉填补方法学空缺。这份中国指导原则同时满足中国与欧盟两套体系的方法学需求。
3.3 逐项对照：同源，五处差异
项目 | ChP 公示稿 | USP〈56〉现行版 | 差异 |
筛查热处理 | 70℃ / 30 min，迅速冷却 | 70～75℃ / 30 min | 基本一致 |
促萌发剂 | 未采用 | 回收与培养基中加 Ca-DPA 60 mM + 十二烷基胺 1.2 mM，提升热损伤芽孢回收 | 差异 |
样品数与对照 | 未规定最少样品数；未明示阳性/阴性对照 | 水溶液品每瓶 10 mL，至少 10 个样品；明确要求阳性对照（接枯草芽孢杆菌）与阴性对照 | 差异 |
沸水浴表 | 表 1：10～100 min → ≥0.1～≥1.0 min | 表 1：10～50 min → ≥0.1～≥0.5 min | 外推 |
N₀ 修正 | 法二把 N₀ 与阴性管数写进公式，并给出表 2 | 无对应内容 | 中方增量 |
D 值测定 | 照 9208：阴性分数法（≥5 组×≥20 支）或残存曲线法（≥5 组×≥4 支） | ≥5 暴露 × 20 重复；计算另可用 Stumbo-Murphy-Cochran 法；回收时限 4 h | 高度同源 |
菌株方面另有一处对应：公示稿方法适用性用枯草芽孢杆菌 CMCC(B)63501，USP〈56〉用 B. subtilis ATCC 6633／NCIMB 8054／CIP 52.62／NBRC 3134，两者为同一菌株的国内／国际保藏号。
五处差异中，促萌发剂一项影响最大。芽孢筛查是整个体系的第一道关口，USP 用 Ca-DPA 与十二烷基胺把"热激活但未萌发"的芽孢也回收出来，灵敏度更高；公示稿走常规 1105 路径，实操更顺，但对低数量芽孢的检出能力理论上要低一截。差距有多大，需要方法学数据支持。
四、本次制定的意义与企业侧动作
结合使用场景，意义体现在四个方面。
第一，注册与检查有了可引用的方法。低 F0 工艺和依生物负荷设计的产品，此前要证明"污染菌耐受性已被考虑"，只能引 USP〈56〉或 PDA 技术报告，国内法规层面没有对应条款。今后发补回复与检查答复里可以直接引中国药典指导原则，方法与判定口径统一，沟通成本显著下降。
第二，把"过度杀灭的前提"变成了必须验证的动作。USP〈56〉早就指出，过度杀灭工艺假定污染菌耐受性可忽略，前提是生物负荷中无芽孢。过去这个前提多靠"假定"过关，公示稿的芽孢筛查把假定变成了实验。对日常监控而言，这是一次实质性的要求迁移。
第三，补齐了 ChP 微生物通则的链条。1105／1106 解决"有多少、有没有"，9208 解决"标准菌株／BI 多耐热"，9210 解决"消毒剂有没有效"，缺的正是"产品自带的污染菌多耐热"。这份指导原则落地后，从生物负荷计数、分离鉴定、耐受性评估到灭菌参数设计，方法链条完整。
第四，方法成本显著降低。法一、法二都只用水浴锅，需要抗力仪的只有最终出具正式 D 值的一步。这与 EMA 指南对低 F0 工艺"生物负荷需表征耐热性"的要求方向一致，做欧盟市场的产品从此多了一个可直接引用的药典方法依据；中美两边方法同源，数据互通的成本也很低。
总结：它没有提高门槛，而是把此前只能靠经验、外文标准和专家共识完成的事，写成了每个实验室都能照做的方法。
企业可以做哪些工作：按优先级分三档
优先级 | 事项 |
高 | 排查本厂湿热灭菌工艺：低 F0 档、依生物负荷法设计或参数放行的产品，对照公示稿自查现有耐热性研究数据是否覆盖芽孢类污染菌 |
高 | 把"芽孢筛查阳性 → 沸水浴耐热性评估 → 必要时 9208 法 D 值测定"这条升级路径写入微生物监测 SOP 与偏差调查流程，明确触发条件与责任岗位 |
中 | 含防腐剂或抑菌成分的料液，方法适用性（去抑菌）不能省；分离菌至少鉴定到属，重点株鉴定到种并留种，供后续耐受性评估复用 |
中 | 使用沸水浴数据时守住边界：写入监测报告、支撑趋势判断可以；用于论证工艺裕度时须记住法一是高估设计、法二内建 N0 保守偏置，两者都不等于真值 |
低 | 提前核对 9208 的硬件口径：正式 D 值测定需抗力仪（满足 GB/T 24628）或油浴；文件中水浴结果只能表述为"估计值" |
对湿热灭菌产品的生产企业，眼下较实际的动作是梳理自家生物负荷监测数据与分离菌档案，当然提意见也是很重要的。假如公示稿正式实施后，"没做过耐热性研究"在检查中将越来越难解释。
来源：智药PharmBiota · mp.weixin.qq.com