生物药清洁验证标准操作规程

PURPOSE

目的

规范本公司生物药（含原液与制剂）生产用设备、部件及共用系统的清洁验证管理，证明已批准的清洁程序能够持续、可重现地将上一产品残留（活性成分及其降解/失活片段）、工艺相关杂质、清洁剂、微生物及其代谢产物（生物负荷、细菌内毒素）清除至可接受水平，有效防止污染与交叉污染，保障患者用药安全与产品质量。

SCOPE

范围

2.1 适用的产品与工序

生物药原液：细胞培养/发酵（生物反应器、培养基与补料配制及储存系统）、收获与澄清（离心、深层过滤、微滤）、下游纯化（层析、病毒灭活/去除、超滤/纳滤、原液配制与储存）；

生物药制剂：配制、除菌过滤、灌装（含冻干、无菌分装相关部件）、包装前与产品接触的部件；

产品类型：单克隆抗体、重组蛋白、融合蛋白、多肽、抗体偶联药物（ADC）及其他生物技术产品。

2.2 适用的设备与清洁方式

设备：生物反应器/发酵罐、配液罐、储液罐、缓冲液系统、离心机、过滤系统、层析系统与层析柱、超滤/纳滤系统、病毒去除系统、管路与阀门、CIP/SIP 系统、灌装与制剂设备部件；

清洁方式：在线清洁（CIP）、离线清洁（COP）、手工清洁及半自动化清洁；

系统形式：不锈钢系统、一次性使用系统（SUT/SUS）以及二者混合系统。

2.3 不适用/另行管理的范围

医疗器械制造用清洁工艺的验证（参见 ASTM F3127）；

洁净室（区）及厂房设施、地面的清洁与消毒；

非产品接触设备表面的日常清洁（纳入污染控制策略 CCS 管理，参见本规程 5.4.5）；

化学原料药合成设备的清洗验证（执行 SOP-B-QA-004）。

2.4 原则性说明

本规程为生物药清洁验证的通用要求。当采用与本规程不同的替代方法时，应经过科学论证并形成书面评估，证明其不低于药品生产质量管理规范相应要求后方可执行。

ROLES

责任

部门/岗位

主要职责

生产部（上游、下游、制剂车间）

起草与审核清洁验证方案、报告；按批准的清洁 SOP 实施清洁并如实记录；参与设备/部件拆卸、取样点与最难清洁部位的确认；配合偏差调查与 CAPA 实施；负责清洁操作人员培训。

工艺开发/技术转移

提供清洁工艺开发数据、实验室规模失活/降解研究数据、残留标记物与 CQA/CPP 识别结论、最差条件评估支持；参与产品分组与设备分组论证。

毒理/安全评估（HBEL 责任岗或有资质的毒理学家）

建立并定期更新产品 PDE/ADE（HBEL）评估报告，提供 NOAEL/NOEL、调整因子取值及依据；HBEL 更新时及时通知 QA 重评清洁限度。

起草并组织实施分析方法确认/验证、擦拭与淋洗取样回收率研究、样品溶液稳定性研究；按方案取样与检验并出具报告；审核清洁验证方案与报告。

审核、批准清洁验证方案与报告；监督按批准方案执行；验证文件编号与台账管理；偏差与变更的审核；组织定期回顾与再验证评估；确认培训有效性。

设备工程部

提供设备技术资料（内表面积、材质、粗糙度、结构图、CIP/SIP 回路图、排水点与死角说明）；设备改造与维护；参与设备分组与取样点识别；仪器仪表校准。

EHS/生物安全

评估含活生物体清洗废液的灭活（kill system）与排放要求；支持病毒、支原体、TSE 等生物安全风险评估。

其他相关部门

按本规程及批准的方案具体实施相关工作。

TERMS

术语与缩略语

术语/缩写

中文

定义或说明

HBEL

基于健康的暴露限度

基于毒理学数据评估得出的日剂量，低于该剂量时终生暴露预计不会产生不良影响；本规程中 PDE 与 ADE 可互换使用（mg/天）。

ADE / PDE

可接受/允许日暴露量

由有资质人员按起始点（PoD，首选 NOEL/NOAEL）与体重调整系数、各调整因子计算得出，用于清洁限度计算（mg/天）。

MACO

最大允许携带量

上一产品允许带入下一产品的最大残留量（mg/或 µg），由 HBEL 或传统方法计算。

SAL

单位面积残留限度

MACO 除以共用设备产品接触总表面积得到的限度（µg/cm²）。

VRL

可见残留限度

通过目视检查可检出的残留物水平，应通过研究确定，且应不高于化学残留可接受限度。

DHT

待清洁保留时间

生产结束（或阶段性生产结束）至清洁开始的最大允许时间间隔。

CHT

已清洁保持时间

清洁结束至下一次使用（或再次清洁/灭菌）的最大允许时间间隔。

CIP / COP / SIP

在线清洁/离线清洁/在线灭菌

CIP 为设备安装位置就地清洁；COP 为拆卸后转移至指定区域清洁；SIP 为就地蒸汽灭菌。

SUT / SUS

一次性使用技术/系统

以一次性组件（袋子、管路、过滤器、层析柱、膜包等）替代不锈钢系统的技术，原则上不清洁、只更换。

HCP / HCD

宿主细胞蛋白/宿主细胞 DNA

生物药特有的工艺相关杂质，清洁验证中按风险评估决定是否作为残留标记物。

TOC

总有机碳

非专属性分析方法，用于检测残留有机物总量，适用于活性成分发生降解/失活的清洁验证。

PSIA

产品特异性免疫分析

如 ELISA，通过识别特定表位间接检测活性成分；注意清洁过程中表位可能降解。

可比质量（方法）

以参比杂质的每剂量可接受暴露量为基准，设定目标杂质（如失活蛋白片段）残留限度的方法。

LOD / LOQ

检测限/定量限

可被检出/可被可靠定量的最低分析物水平；LOQ 必须低于清洁验证可接受限度。

CFU / EU

菌落形成单位/内毒素单位

生物负荷与细菌内毒素的计量单位。

TSE

传染性海绵状脑病

使用动物源成分（血清、胰酶等）时需评估的风险。

DHT/CHT 之外的 CPP

清洁关键工艺参数

直接影响清洁关键质量属性（CQA）的参数，如温度、压力、流量、时间、清洁剂浓度、循环次数等。

PROCEDURES

程序

5.1 清洁验证基本原则与生命周期

5.1.1 全生命周期管理

清洁验证生命周期分为三个阶段，各阶段输出应形成文件并纳入验证台账管理：

阶段 1—清洁工艺设计和开发：分析残留物特性；确定 HBEL；选择清洁剂；开发清洁工艺；识别清洁 CQA 与清洁 CPP；审核设备设计；产品分组与设备分组；定义可接受标准；开展取样回收率与分析方法研究。

阶段 2—清洁工艺验证：确认设备与公用系统准备情况；选择取样位置、方法与策略；完成回收率研究与方法验证；论证验证批次数；起草并批准方案；培训人员；执行方案；输出验证报告。

阶段 3—持续清洁工艺确认：日常监测；定期回顾审核；变更后的评估与再验证。

研发阶段应收集药理、毒理与理化性质数据；技术转移阶段可开展清洁确认；商业化生产阶段开展清洁验证与持续清洁工艺确认。后一阶段获得的知识或数据如表明清洁工艺需要调整，应回到上一阶段进行再设计、开发或再验证。

5.1.2 质量风险管理

风险管理贯穿清洁验证全生命周期，风险评估应基于科学知识与经验，重点评估对产品质量与患者的影响；

采用的风险管理工具、措施与文件详尽程度应与风险级别相适应；风险管理是动态、持续改进的过程，其输出应定期审核；

不得以风险评估为由规避法律法规及规范要求。

5.1.3 验证与确认的选择

商业化生产中共用设备：应按最差条件开展清洁验证，通常一个清洁程序至少连续 3 次成功应用，方可证明其适用性；

临床样品、不经常生产的产品或处于研发阶段的产品：可采用每批生产后清洁效果确认的方式替代清洁验证；

专用设备（仅用于单一产品单一工序）：至少进行 1 次清洁确认；对高活性、高毒性、难清洁或难检测的产品宜采用专用设备；

清洁验证应证明日常使用的清洁程序一次即可达到可接受标准，不得以多次清洗后达标作为合格依据。

5.1.4 清洁验证总计划

应基于风险评估制定清洁验证总计划（可单列或纳入验证总计划），描述本公司生物药清洁验证的总体计划、基本原理与方法，包括产品/设备分组策略、限度计算方法、取样与分析策略、验证批次数原则、持续确认策略，经质量管理部门批准。

5.2 风险管理与最差条件评估

5.2.1 风险分析对象

至少应对以下方面进行风险分析，并评估其对清洁效果及后续产品的影响程度，据以确定清洁验证的范围与程度：

关键操作（清洁步骤、拆卸与装配、干燥与保存）；

设备与部件（结构、材质、粗糙度、死角、可排水性、CIP/SIP 回路）；

物料（活性成分及其中间体、培养基与缓冲液组分、试剂与工艺助剂、清洁剂）；

清洁参数（时间、作用、浓度、温度）及其波动范围；

DHT 与 CHT；

微生物增殖与内毒素风险；

阶段性生产的批次数与连续生产时间。

5.2.2 最差条件评估内容

最差条件应在验证方案或单独文件中描述并论证，至少包括：

最差条件的产品/设备（含产品分组与设备分组的代表性选择）；

残留标记物的选择；

最差的清洁参数：最短清洁时间/最少清洁次数、最差清洁温度、最小压力/最低流速、最低清洁剂浓度与体积、最长生产时间（批次数）、最长 DHT；

最长的 CHT；

阶段性生产的最大批次数和/或最长连续生产时间。

5.2.3 产品分组

按活性/毒性、溶解性、可检测性、浓度、黏度与吸附性进行风险评估，选择组内最难清洁的产品作为代表；生物药还应考虑分子量与等电点、聚集与变性倾向、宿主细胞蛋白与 DNA 水平、培养基与宿主来源等因素；

当理论评估不足以证明可清洁性时，应采用与设备表面材质相同或更差（粗糙度等同或更差）的材质试样，以相同清洁工艺与清洁剂开展实验研究，确定相对可清洁性；

若最难清洁产品能被清洁至组内所有产品的最低可接受标准，则组内采用同一清洁工艺的产品均可视为通过清洁验证；

清洁验证完成后，经评估必要时可选取组内最低允许残留限度的产品额外验证，或切换产品时再进行一次清洁确认；

高风险、难以清洁或难以达到可接受标准的产品应采用专用设备。

5.2.4 设备分组

组内设备设计与功能相同、清洁工艺相同；应从设备大小、结构、表面类型与特性（材质、粗糙度等）及设备确认情况综合评估风险；

如仅大小不同，至少选择最大与最小两个型号（两个极端）作为最难清洁设备；

如经评估大小、结构、表面特性均一致，可选择组内一台或多台进行验证，其余设备纳入持续清洁工艺确认。

5.2.5 组内引入新产品或新设备

引入较易清洁的产品/设备、且新限度不严于原有限度：可采用现有清洁程序，通常进行 1 个批次的清洁确认；

引入更难清洁的产品/设备：可能需要调整现有清洁工艺并开展验证；

引入后导致现有清洁验证可接受标准变严：应依据历史数据重新评估现有清洁工艺的适用性，必要时调整并再验证；

引入新产品/设备时，其残留限度的计算原理应与原组内其他产品保持一致。

5.3 残留物识别与残留标记物选择

应根据工艺与产品特点识别清洁后可能残留的物质，并按溶解度、组成占比、黏度与吸附性以及风险高低选择残留标记物。

残留物类别

典型来源（生物药）

是否作为残留标记物

常用检测/评价方法

活性成分（蛋白、多肽）

原液、制剂

是（首选）

HPLC/SEC、CE-SDS、ELISA/PSIA、TOC、生物活性测定

降解/失活片段

清洁过程中极端 pH、加热、蒸汽处理产生

是（未完全失活时）

SDS-PAGE、生物活性测定、TOC、肽图

宿主细胞蛋白（HCP）

细胞培养/发酵产物

按风险评估

HCP ELISA

宿主细胞 DNA（HCD）

细胞培养/发酵产物

按风险评估

qPCR/分子生物学方法

配基脱落物（如 Protein A）

亲和层析

按风险评估

特异性 ELISA

培养基组分、消泡剂、诱导剂

上游工序

按风险评估

TOC、专属性方法

清洁剂（NaOH、酸、配方清洁剂）

清洁过程

是

电导率、pH、TOC、专属性方法

缓冲盐

配液与纯化

通常否

电导率

生物负荷（微生物）

设备、水、环境

是

薄膜过滤法、接触碟法、倾注/涂布法

细菌内毒素

革兰氏阴性菌、水系统

是（无菌相关工序）

凝胶法/光度法（LAL）

病毒、支原体、TSE 因子

宿主细胞、动物源成分

按生物安全评估

病毒清除/灭活研究、TSE 风险评估

表 5.3-1 生物药常见残留物与残留标记物选择（示例，应按实际产品与工艺调整）

当无法直接检测某些特殊残留时（如成分复杂或检测成分已降解），可选择非专属性方法（TOC、电导率）检测，但非专属性方法的限度设定应科学合理，并应证明活性物质可通过清洁过程降解或失活（变性）。

5.4 清洁工艺设计与参数要求

5.4.1 清洁方式与步骤

清洁方式包括自动化清洁（CIP）、手工清洁与半自动化清洁；按清洁位置可分为在线清洁（CIP：在线系统清洁、溶剂回流、溶剂循环、人工辅助）与离线清洁（COP）；

清洁工艺通常包括预处理、清洁剂洗涤、冲洗、干燥等步骤；各步骤应明确预定功能；

离线清洁应确保清洁剂充分接触并冲洗到部件内腔、软管内部等所有部位。

5.4.2 清洁工艺参数（TACT）

时间：清洁步骤的持续时间，可直接计时，也可间接以冲洗体积、电导率终点等方式记录；

作用：浸泡、洗涤、冲击/湍流、搅拌等；如流速为关键因素，应规定并确认流速或压力；

浓度：清洁剂浓度；过低可能无法去除污染物，过高可能导致清洁剂残留难以冲洗；

温度：首次冲洗通常在常温下进行，以减少蛋白变性固化；清洁剂可加热以提高有效性；最终冲洗可在较高温度下进行以提高溶解度与干燥速率。

5.4.3 生物药特有考虑

含活生物体的清洗废液在排入主废物系统前，应先进入“灭活（kill）“系统处理；必要时清洁前先进行灭菌/灭活处理；

上游系统（生物反应器、培养基制备容器、离心、过滤、均质等）如需清洁验证，可利用后续纯化步骤可去除残留的研究数据适当简化，但应形成书面论证；

蛋白残留：首次冲洗宜采用常温水；应关注罐壁液面处/气液界面形成的“环带“残留、喷淋覆盖盲区与生物残留物累积；必要时增设人工擦洗或酶促降解步骤；

生物膜：水系统、缓冲液系统与连续运行设备应重点评估生物膜形成与清除，必要时采用杀菌剂/消毒剂并定期评估；

排水与干燥：CIP 与 SIP 冷凝水管路常共用低点排水点，疏水阀应设置过滤；清洁后设备应完全排空并干燥（如洁净压缩空气或氮气吹扫），防止残留水分导致微生物繁殖与内毒素升高；

死角控制：管道与互连应完全可排空并朝排水点向下倾斜，容器中三通与死角应最小化；

腐蚀/表面劣化：应管理不锈钢腐蚀（如红锈）、塑料化学侵蚀与玻璃分层，监测产品接触面并在目视检查标准中识别，必要时采取钝化或化学处理。

5.4.4 手工清洁

手工清洁应在文件中详细规定拆卸程度、清洁过程与方法、工具、清洁剂与参数；

应对清洁人员进行培训与考核，评估不同操作人员执行的一致性；低 PDE/ADE 产品宜采用自动清洁或专用设备；

可通过交替使用清洁剂、延长清洁时间或提高清洁剂浓度等方式提升手工清洁的稳定性。

5.4.5 待清洁设备表面的分类管理

与产品直接接触表面：清洁验证的重点，计算限度时应统计不同产品间共用的所有设备总表面积；清洁剂残留限度应按所有与清洁剂接触的设备总表面积计算；

与产品间接接触表面（如冻干机板层、托盘干燥器腔体、流化床进风过滤器腔体、灌装设备间隙等）：应纳入清洁验证计划，验证程度通过风险评估确定，可采用目视、在线监测、擦拭或淋洗取样；

非产品接触表面（如设备外表面）：通常不需清洁验证，但应纳入污染控制策略，按设备类型、使用频率与交叉污染风险确定清洁频率与范围。

复杂设备可转化为基本几何图形测算表面积，必要时增加安全系数；测算原始记录或经确认的供应商表面积资料应作为原始数据保存。

5.4.6 清洁剂选择

原则：广泛有效性、与设备材质（不锈钢、聚合物、玻璃、软金属及层析介质/膜包）相容、易冲洗、低毒、稳定、可分析、满足排放与安全要求；

常用清洁剂：水及水溶性清洁剂（酸/碱溶液，可促进水解）、有机溶剂（原料药合成工序常用，需注意易燃易爆）、配方清洁剂（润湿、渗透、乳化、螯合、分散等协同作用）；

清洁用水质量不应低于相应药品生产用水要求，并符合其用途的化学、微生物与细菌内毒素限度；

清洁剂供应商应具备相应质量管理体系与变更控制程序，其可能影响清洁效果的变更应告知用户并由用户开展风险评估。

5.4.7 清洁标准操作规程与记录

清洁 SOP 至少应包括：适用范围；清洁前拆卸与清洁后装配要求；关键部位与难清洁区域的重点清洁和特定检查要求；清洁方式；清洁剂名称、浓度、成分与配制方法；清洁方法（材料与工具）；清洁工艺参数；DHT；清洁效果检查方法与合格标准；清洁后的干燥与保存方式；CHT；阶段性生产的最大批次数和/或连续生产最长时间。每次清洁均应填写清洁记录，记录应包括清洁关键工艺参数与检查结果；自动化清洁可采集、存储或直接打印控制系统数据。

5.5 可接受标准

5.5.1 总则

可接受标准应科学合理、可实现，并可通过适当方法检验；

同一残留物采用多种方法计算时，应进行比较并取其中最严的限度作为可接受标准；

可接受标准应包括目视检查、活性物质和/或清洁剂残留、微生物和/或细菌内毒素（如适用）等；

限度应随产品毒理学数据更新、工艺变更、法规要求变化而定期评估与更新。

5.5.2 目视检查限度

目视检查是清洁验证限度的首要可接受标准，但通常不得作为单一可接受标准使用；

目视检查标准：无可见残留物，设备表面干燥（无法干燥时应说明理由）；

检查时应考虑表面位置与特性、环境照度、观测距离、观测角度及人员视力，建议使用内窥镜、相机或摄像头等手段提高可靠性；

宜通过 VRL 研究确定可见残留限度，VRL 应不高于化学残留可接受限度；未建立 VRL 时以“无可见残留物“判定，并将其与化学残留检测结合使用。

5.5.3 活性物质残留限度

（1）基于健康的暴露限度（HBEL）方法（首选）

可按下列公式由 PDE/ADE 计算 MACO：

MACO（mg）= PDE/ADE 上一产品（mg/天）× MBS 下一产品（最小批量，mg）/ TDD 下一产品（日治疗剂量，mg/天）

其中 PDE/ADE 按下列公式计算（因子取值见附录 F）：

PDE = PoD × 体重调整系数 /（F1×F2×F3×F4×F5）

ADE = PoD × 体重调整系数 /（UFc × MF × PK）

应建立 HBEL 确定与定期更新的程序文件，评估报告应由具备药理、毒理学背景的专业人员参与并批准；

评估应包含产品毒理试验数据或毒理学文献，并在产品生命周期内定期评估；

当毒理学计算的残留限度低于传统限度时，应采用毒理学计算的限度；当毒理学限度高于传统限度时，可继续采用传统限度，也可经充分科学的风险评估后采用毒理学限度，并将传统限度设为警戒限。

（2）生物药降解/失活情形的处理

生物药清洁通常将产品接触表面暴露于极端 pH 和/或加热条件，活性成分会发生降解与变性并可能失去药理活性；应通过实验室规模失活研究（模拟最不利于失活的最差条件），采用 SDS-PAGE、生物活性测定等方法评估失活程度；

研究数据表明活性成分已完全失活：可基于失活产物设定可接受限度（如采用可比质量 CQ 方法，以合适的参比杂质每剂量可接受暴露量为基准，例如以明胶为参比杂质时每剂量不超过 0.65 mg/剂），并形成书面论证；

研究数据表明活性成分未完全降解或失活：仍应使用 HBEL 计算活性成分的残留限度；部分失活时应分别确定活性成分与失活产物的限度并取较低者，或调整操作参数以确保失活；

生物药原液早期工序：如有研究数据支持后续加工步骤（层析纯化、超滤等）可去除早期工序滞留的残留物，早期工序的清洁验证要求可适当放宽；可按最后一步纯化步骤之后的设备表面积计算，或采用上游工艺 TOC 5–10 ppm、下游工艺 TOC 1–2 ppm 的限度值；

下游使用的层析介质、超滤膜包等产品专用材料，可设定相对较高的限度，但必须评估其多次重复使用后的可清洁性；

ADC 等产品除关注生物活性成分残留外，还应考虑所偶联小分子药物的残留，其限度计算可参照化学药品方法。

（3）传统方法与过渡管理

缺乏 HBEL 数据时（如临床早期、清洁剂、中间体），可采用 1/1000 最低日治疗剂量法、10 ppm 一般限度法或 LD50 法计算，取最严者；

过渡期应在程序文件中规定从传统限度向基于 HBEL 限度过渡的方案与时间表；

残留溶剂可参照 ICH Q3C 评估；对易挥发性溶剂，若有充分研究证明其可挥发至低于允许残留限度，可不设定限度；下一产品生产前使用相同溶剂冲洗或使用相同溶剂生产的，可不设定限度。

（4）后续产品的考虑

计算残留标记物的最低残留限度时，应考虑所有“后续产品“；后续产品不确定或仅生产一轮时，至少应考虑下一产品；

验证结果不能满足所计算的最低限度时，可在程序文件中限定后续产品的生产顺序。

5.5.4 工艺相关杂质与清洁剂残留

HCP、HCD、Protein A 等工艺相关杂质的残留限度应基于风险评估设定，原则上是不得使后续产品相应杂质超出其注册标准或内控标准，且不得引入新的杂质类别；

清洁剂残留限度应基于其毒理学数据（HBEL/LD50）或采用通用限度（如 10 ppm）计算，计算时应采用所有与清洁剂接触的设备总表面积；氢氧化钠、磷酸等可溶且不与表面反应的清洁剂，经充分评估可豁免取样回收率研究，并可采用电导率/pH 判定冲洗终点。

5.5.5 微生物与细菌内毒素限度

项目

取样方式

可接受标准（示例）

说明

生物负荷（非无菌工序）

擦拭取样（通常 25 cm²）

1–2 CFU/cm²

下一产品微生物限度更严时，应采用下一产品的限度，或经评估不低于取样环境级别微生物要求

生物负荷（非无菌工序）

淋洗取样（纯化水）

100 CFU/mL

采用注射用水淋洗时一般设定为 10 CFU/100 mL

生物负荷（无菌相关工序）

淋洗取样（注射用水）

10 CFU/100 mL

也可采用其他经评估的限度值

细菌内毒素

最终淋洗水

< 0.25 EU/mL（等同注射用水）

下一产品有内毒素检查项时应检测；如不检测须进行科学评估

细菌内毒素（发酵/收获）

最终淋洗水

可不设限度或放宽至 5–25 EU/mL

适用于使用革兰氏阴性菌（如大肠杆菌）发酵的生物制品

表 5.5-1 微生物与细菌内毒素可接受标准（示例，应按产品与工序风险评估确定）

清洁的微生物验证应与化学残留验证同步进行；

CHT 验证的可接受标准中应包括微生物限度（如有）与细菌内毒素（如有）；

层析介质、超滤膜包等专用材料的储存条件（储存液、温度、有效期）应按供应商说明与验证数据确定。

5.5.6 病毒、支原体与 TSE

使用动物源成分（如血清、胰酶）时应开展 TSE 风险评估并形成文件；

清洁工艺对病毒的灭活能力应有研究或文献数据支持，必要时开展病毒清除/灭活研究；下游工序的病毒清除验证数据可作为支撑材料；

清洁工艺、宿主细胞、培养基或动物源成分发生变更时，应重新评估上述风险。

5.5.7 限度换算与结果判定

单位面积残留限度与样品限度的换算按下列公式执行：

单位面积限度 SAL（µg/cm²）= MACO（µg）/ 共用设备产品接触总表面积 SA（cm²）；

擦拭样品残留限度（µg/mL）= SAL（µg/cm²）× 取样面积（cm²）/ 取样液体积（mL）；

淋洗样品残留限度（µg/mL）= SAL（µg/cm²）× 淋洗设备内表面积总和（cm²）/（淋洗液体积 L × 1000）；

取样回收率修正：回收率 ≥ 70% 时通常可不需修正；回收率在 50%–70% 时应当修正残留限度或分析结果；回收率低于 50% 通常不可接受。本公司按从严原则执行：实测残留结果均按经确认的回收率校正后报告，计算方式应在方案中明确；

判定：各取样点的目视、化学残留、微生物与内毒素结果均应符合可接受标准方可判定合格；任一项目超限应按偏差处理，并评估对已生产及后续产品的影响。

5.6 取样

5.6.1 取样点确定原则

应对设备/系统所有位置进行风险评估，选取代表性点位；取样点应为理论或实际易残留和/或难清洁的位置；

确定依据包括：设备材质与粗糙度（粗糙度差的位置更不易清洁）、结构复杂处、死角、清洗溶剂较难达到处、物料持续接触部位、易积水的设备最低点、较难干燥的部位；

应兼顾取样操作的可实现性；不同材质应分别设置代表性取样点；

取样点应结合清洁实践不断优化，并在验证方案中对选择理由进行阐述。

5.6.2 生物药典型设备取样点示例

设备/系统

典型取样位置

选择理由

生物反应器/发酵罐

罐壁液面处与气液界面、搅拌轴与桨叶、挡板背面、喷淋球覆盖盲区、底部阀与取样阀、气体分布管、视镜口内壁、CIP 回路死角

气液界面与喷淋盲区易残留；搅拌与死角处溶剂难到达；底部阀易积水

配液罐/储液罐/缓冲液罐

罐顶与喷淋盲区、液面环带、搅拌器、底部排放阀、液位计/传感器接口、人孔/快开接口垫片内侧

液面处残留累积；盲区与垫片处难清洁

层析系统

柱头/柱尾筛网与分配器、阀组与阀膜、进出口管路、泵腔、UV/电导流通池、收集阀、缓冲液管路低点

流道复杂、阀组多、易残留与积水；柱体按层析介质管理

超滤/纳滤系统

膜包进出口、循环罐、回流管路、压力表与传感器接口、阀组、管路低点与死角、滤膜夹具内侧

膜包与管路循环路径复杂，残留易累积，需评估可清洁性

管路、阀门、软管

弯头、三通盲端、快接头、垫片内侧、软管内壁、过滤器外壳内壁

盲端与接头处难清洁、易积水

除菌过滤与灌装部件

分液器、泵体（陶瓷/金属/蠕动泵管）、灌装针内外表面、针座、胶塞/轨道等间接接触部位

拐角与残留物易积聚处；间接接触表面按风险评估取样

冻干机（间接接触）

板层表面、腔体内壁、冷凝器盘管、门封与死角

间接接触产品，按风险评估采用目视/在线监测/擦拭或淋洗取样

表 5.6-1 生物药典型设备取样点示例（应按实际设备结构与清洁方式确认）

5.6.3 取样方法与要求

取样方法包括目视检查、擦拭取样、淋洗取样、接触碟取样等；通常应采用多种方法相结合（如目视检查加擦拭/淋洗）；

擦拭取样：一般取 5 cm × 5 cm；限度较低时可采用 10 cm × 10 cm、增加进样量、减少提取溶剂体积或适当浓缩；先湿润拭子并挤出多余溶剂，以足够力度使拭子完全接触表面，单向平稳擦拭后翻转拭子，在垂直方向擦拭同一区域；

淋洗取样：可采用最终冲洗过程“抓取“最后一部分冲洗液，或冲洗结束后单独加入定量溶剂（通常 0.5–1 mL/cm²）进行独立淋洗取样；淋洗液不应大于正常生产所用体积，且应能覆盖所有产品接触表面；

接触碟取样：仅适用于平整或近似平整表面的微生物取样；采样后应清除培养基残留；

微生物取样应严格执行无菌操作，避免取样过程引入微生物污染；取样后对取样面进行适宜处理（如以纯化水/注射用水擦拭），以避免取样溶剂残留影响后续生产；

取样顺序：先目视检查，再进行擦拭取样，必要时最后进行淋洗取样；同一位置不得重复擦拭取样；

必要时取空白（对照）样品；细菌内毒素取样通常采用最终淋洗水，并应控制清洁用水的内毒素水平。

5.6.4 取样时限与样品保存

清洁结束后一般应在 24 小时内完成取样；对易滋生微生物或样品不稳定的产品/设备，应在 8 小时内或按方案规定的时间内取样；

QC 应对样品溶液的稳定性进行研究，确定贮存条件与有效期，并在方案中明确；检测应在有效期内完成。

5.6.5 取样回收率研究

应在与实际设备相同或相似的材质试样上进行（不锈钢 316L、搪玻璃、PTFE、EPDM、硅胶、聚丙烯、PVDF、玻璃等），涂布量应与残留限度相当；

擦拭回收率：每种残留物与表面类型的组合至少由 2 人进行，每人至少重复 3 次，取每人最低平均值作为确定值；同一涂布水平的 RSD 通常不超过 30%；

淋洗回收率：可在实验室模拟实际淋洗条件（溶剂、温度、用量、方式、时间）进行，由 1 名操作人员重复 3 次；合格标准与擦拭法一致；

回收率 ≥ 70% 通常可不需修正；50%–70% 应修正；低于 50% 通常不可接受；

微生物取样经研究评估后可不对回收率进行要求；细菌内毒素回收率研究存在困难时，可基于对后续产品的影响程度确定是否开展；

可溶且不与表面发生反应或被吸收的残留物（如氢氧化钠、磷酸等清洁剂），经充分评估可不进行取样回收率研究；

产品接触面总表面积占设备总面积比例很小（如低于 1%–2%）且无特殊高吸附材质时，经评估可不单独研究，其回收率可采用其他表面的最低值或规定的最低回收率限度；

清洁过程中活性成分降解时，通常加入活性成分本身进行回收率研究；若降解产物具有异常的安全性或溶解性问题，应直接加入降解产物进行研究。

5.6.6 取样人员资质

取样人员培训应包括取样步骤学习、观看已培训人员示范、在已知残留水平的材质试样上实操考核；

目视检查人员应通过 VRL/材质试样考核；应定期对取样与目视人员资质进行再确认。

5.7 分析方法

5.7.1 方法选择原则

活性成分未发生变化时首选专属性方法；发生变化时应同时采用专属性与非专属性方法；仅采用非专属性方法时应充分论证；

生物药成分复杂、残留物来源多样，通常同时采用专属性与非专属性方法；采用非专属性方法检测具有生物活性的残留物时，应证明清洁过程可使活性物质降解或灭活（变性）；

选择时应综合考虑仪器可得性、检测速度、专属性、取样限制、LOD/LOQ、线性、在线检测可行性与成本。

5.7.2 常用与可选分析方法

方法

类别

适用与注意点（生物药）

总有机碳法（TOC）

非专属性

适用于活性成分发生降解的清洁验证；将所有检测到的残留物均假设为残留标记物；结果大于 500 ppb 时应建立线性范围等项目

电导率法/pH 法

非专属性

适用于清洁剂残留与冲洗终点判定；pH 法可作为电导率法的补充

HPLC/UPLC

专属性

适用于活性成分及其可分离降解物的测定；活性成分发生降解时可能不适用

毛细管电泳（CE-SDS）

专属性

适用于生物技术产品中活性成分及其降解物的检测

ELISA/PSIA（含 HCP、Protein A 试剂盒）

专属性

灵敏度高（约 10 ppb 量级）；清洁过程中表位可能降解，结果可能具有误导性，应结合其他方法判断

SDS-PAGE、生物活性测定

专属性

用于失活/降解研究与失活程度评估

qPCR/分子生物学方法

专属性

用于宿主 DNA、工艺杂质等检测

薄膜过滤法/接触碟法/倾注法

微生物

用于生物负荷检测；应根据可接受标准与样品含菌量确定检测样品量

细菌内毒素检查法（LAL）

微生物

药典方法，通常确认适用性即可；含螯合剂、表面活性剂等复杂成分时应进行干扰试验

感官评价（目视、嗅觉）

非仪器

用于各阶段残留去除、颜色与异味的检查

表 5.7-1 生物药清洁验证常用分析方法

5.7.3 分析方法验证

验证指标通常包括准确度、精密度、专属性、线性、范围、LOQ、LOD 与耐用性；LOQ/LOD 必须低于样品的可接受限度；

通常方法精密度 RSD 要求不超过 20%；使用定性方法时可简化验证；引用药典方法时应针对低含量水平确认适用性；

应评估样品贮存条件（时间、温度、容器）对稳定性的影响；专属性方法还应关注清洁剂等干扰物的影响；

拭子材料、取样溶剂与取样回收率可能带来的干扰应在方法适用性中评估。

5.7.4 灵敏度不足时的处理

增大擦拭取样面积（如 10 cm × 10 cm）；

减少提取溶剂体积或对样品溶液适当浓缩；

增加进样量或采用更高灵敏度的方法（如由 TOC 改为专属性免疫分析）。

5.8 清洁验证的实施

5.8.1 方案要素

清洁验证方案至少应包括：

验证概述（目的、范围）与角色职责；

清洁验证涵盖的系统（设备与部件）及其描述；

清洁设备的残留物描述与残留标记物选择依据；

清洁标准操作规程（列明清洁参数与其他要求）；

清洁验证次数要求及合理性说明；

验证前需完成工作的确认清单；

检测分析方法选择与验证（或确认已完成）、取样方法及回收率研究；

取样计划与取样点位（含目视检查点）；

样品保存条件（必要时）与检测时限；

清洁残留的可接受标准（含设定理由）；

偏差与变更控制；

清洁验证合格的判定标准。

方案应经质量管理部门审核批准。

5.8.2 验证前确认

执行前至少应确认：清洁 SOP 已建立并完成培训；方案培训完成；分析方法与回收率研究完成；清洁相关设备确认完成；仪器仪表已校准；取样（含目视）人员已完成培训与资质确认；清洁验证所用物品（工具、清洁剂等）已准备；取样点已确认；偏差处理流程已建立。

5.8.3 验证次数

通常一个清洁程序至少连续 3 次成功应用，方可证明其适用性；

阶段性生产：通常至少安排 3 个连续相同批次数/时间的阶段性生产实施验证；不易执行时，可在生产指定批次数后进行清洁验证，如需延长连续生产批次数，应对更长的连续生产批次数进行清洁验证；

采用其他验证次数应有基于风险与历史数据的书面论证。

5.8.4 报告要素

验证执行前相关事项的记录、验证实际进度；

清洁程序执行确认记录（关键参数、人员、时间、DHT/CHT 等）；

检测结果与数据分析（目视、化学残留、清洁剂残留、微生物、内毒素）；

取样记录（方法、位置、人员、时间）；

回收率与方法验证结果引用；

偏差与变更的处理；

验证结论（是否成功验证）与建议（含后续持续清洁工艺确认策略、适用产品与设备范围、生产顺序限制等）；