标准菌株代次与保藏管理要点：依据中国药典9203与GB 4789.28—2024梳理第0代到销毁

微生物实验室里容易在检查中被开出缺陷项的，往往不是昂贵的仪器设备，而是菌种冰箱里那几支不起眼的小管。

培养基验收、方法适用性、阳性对照、人员考核、消毒剂效力评估，每一项质量控制活动的背后都离不开标准菌株。一旦它来源不清、代次失控、保藏失当，前面再好看的检测数据，也可能因一句"菌株不可溯源、代次无法追溯"而被推翻。

今天讲讲菌株：把一支菌株"从哪来、怎么存、能传几代、到哪一步必须销毁"这条链路，一环一环讲一讲。依据两部现行文件，即《中国药典》2025年版四部通则 9203《药品微生物实验室质量管理指导原则》，以及 GB 4789.28—2024《食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》。

01 先把"代次账"算清楚

菌株管理中的大量争议，最后都落到同一个问题：这支菌现在算第几代？还能不能用？要回答，先得把菌株的几个层级认清楚。

认清单层级之后，有三条硬性要求必须严格执行：

要求一 · 代次总量不超过 5 代

药典规定：工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过 5 代（从菌种保藏机构获得的标准菌株为第 0 代）。之所以设此上限，是因为传代越多，菌株老化、退化、变异、特性变异的可能性越大，检测结果的重现性越难保障。药典指导原则 9204 也提示，表型鉴定时应关注传代次数对鉴定结果的影响。

需要补充的是：GB 4789.28—2024 侧重菌株的层级管理与保藏（规定各级菌株"不能逆向制备"）。食品微生物实验室若需量化依据，可参照 CNAS-CL01-A001:2022 第 6.4.3.1 条——工作菌株的传代次数原则上不得超过 5 次（从菌种保藏机构获得的标准菌株可视为第 0 代），除非标准方法另有要求，或实验室能证明其相关特性没有改变；GB/T 27405亦有"标准培养物从储备菌株起传代培养次数不得超过 5 次"的同类规定。

这里有一个需要澄清的常见误解："不超过 5 代"应从第 0 代起累计计算，而非"工作菌株还能再传 5 次"。行业通行的做法，是把工作菌株控制在第 3～5 代区间。

要求二 · "一代"的算法要统一

药典口径明确：只要把活的培养物接种到新鲜培养基中培养，无论采用何种形式，一律计为传代 1 次。斜面转平板、液体转液体、挑单菌落重新划线，均各自算一代。实验室内部须先统一这一口径，否则"代次"会因人而异。

要求三 · 工作菌株只能使用，不能继续传代

工作菌株的来源方式与保藏条件，决定了它不具备继续向下稳定传递的能力。药典规定工作菌株不可替代标准菌株；GB 4789.28—2024 进一步明确，工作菌株不能用于制作标准菌株、标准储备菌株或储备菌株。需要新的工作菌株时，应回到上一代的标准储备菌株或储备菌株重新制备，而不是由旧工作菌株继续转接。同样，冷冻菌种一旦解冻并转种制备工作菌株，不得重新冷冻后再次使用，这一点药典规定明确。

02 接收、复苏复壮、保藏、使用：四步实操

第一步 接收与验收

菌株到货不是签收即了事。开箱后应核对名称、编号、数量、代数、来源机构、接收日期与接收人，逐支检查包装完整性以及是否干瘪、破损、受潮。相关信息当日记入台账，并按规定温度入库（冻干管常以 2～8℃ 暂存，具体以供应商说明为准）。台账信息不完整，是实验室最常见、也最容易在检查中被开缺陷项的问题。

第二步 复苏与纯度、特性确认

复苏、复壮及培养物的制备，应按供应商说明进行，或采用经确认有效的方法（药典对此有明确要求）。复苏培养基宜选用营养全面、非选择性的类型，如 TSA/TSB、NA/NB、SDA/SDB 等；个别要求特殊的菌株若在常规培养基上生长不良，应补充相应生长因子。

备注："标准储备菌株应进行纯度和特性确认""必要时对工作菌株进行确认"为药典 9203 的规定；具体方法组合属行业常规做法。鉴定技术路径见药典指导原则 9204（其正文相应表述为"为了确证微生物为同种中的两个相同株，需比对更多的基因序列和特征基因片段，甚至是全基因组序列的比对"）。

从开启、复苏、复壮到纯度与特性确认，每一步都要有记录。这条链路断在哪一环，出现问题时就无法追责清楚。

第三步 保藏：先问"要存多久、多久用一次"

药典建议标准储备菌株采用低温冷冻干燥、液氮贮存、超低温冷冻（低于 -30℃）等方式保存，并指出低于 -70℃ 或冻干可延长保存时间。实操中如何选择，取决于用途和取用频率：

备注：上表中温度与保存期属行业经验范围，非标准强制值；冻干、液氮、超低温（低于 -30℃）为药典 9203 推荐方式，并指出低于 -70℃ 或冻干可延长保存时间；GB 4789.28—2024 则将超低温保藏表述为"不高于 -70℃"。具体参数以本实验室验证结果为准。

两点实操建议

冷冻管在降温时宜采用分级预冻（例如先 -20℃ 再转 -70℃），降温过快形成冰晶会损伤菌体；甘油终浓度过高同样损伤菌体。这些并非标准条文，但直接影响复苏率，属实验室内部参数，应写入本实验室的 SOP 并做验证。

第四步 制备工作菌株与使用

药典给出的节奏较为实用：以标准储备菌株制备每月或每周转种一次的工作菌株。这样既能保证随时有新鲜的工作菌株可用，又不必频繁扰动长期保存的母液。一旦发现工作菌株活力下降、形态异常或疑似污染，不应勉强使用，应弃用并从上一代重新制备。

03 最容易被忽略的六个细节

以下几条不写在检测步骤里，却往往决定检查结论。

① 专人保管、加锁存放 高

菌种应设专人管理（药典人员条款中即列有"菌种管理员"岗位），保藏地点采取加锁、双人保管等措施，使非授权人员不能轻易获取。这并非形式主义，而是防丢失、防误用、防生物安全事故的底线。

② 标签与记录完整 高

标签应至少注明名称、标准号（如 CMCC 编号）、接种日期、传代数，并与台账一致。记录中还应体现所用培养基、培养条件、保藏位置与保藏条件。标签脱落或代次模糊，等同于菌株身份不明。

③ 记录覆盖全生命周期 高

药典要求建立从标准菌株到工作菌株的文件与记录，覆盖申购、进出、收集、贮藏、确认、转种、使用、销毁全过程。其中"使用"和"销毁"同样需要留痕，不少实验室恰恰在这两端留白。

④ 关键设备应有备用 中

药典明确提出，培养箱、冰箱等应由专人维护保管，并配备相应的备用设备，以保证试验菌株和微生物培养的连续性；同时应对温度（必要时压力）进行连续监测记录。一次停电导致超低温冰箱回温，可能使整批菌株报废。

⑤ 使用商业派生菌株须说明等效性与溯源 中

药典允许使用商业派生菌株，前提是"与标准菌株所有相关特性等效"且"可溯源"。这里"溯源"有两层含义：一是来源与去向的链条清晰合法，二是技术层面可核查（如株水平的鉴定识别）。若拟以商业派生菌株替换，建议先做与标准菌株结果的差异分析和风险评估，再作决定。同时需注意，药典规定标准菌株的商业衍生物仅可用作工作菌株；据"工作菌株不可继续传代"的规则，它也不宜再作为母株向下传代。

⑥ 该销毁时及时销毁 中

标准菌株经确认试验证明已老化、退化、变异、污染，或已无使用需要时，应及时灭菌销毁并记录。过期、失效、可疑的菌株长期存放在冰箱中，是隐患而非"以防万一"。销毁方式与处置应符合实验室污染废弃物管理的相关规定。

04 菌株管理自查清单

将上文要点整理为自查表，建议每季度或每次内审前执行一次。

菌株管理可以归结为一句话：每一支菌株都要能说清"从哪来、到哪去、现在第几代、还能不能用"。标准条文已经给出框架，难点在于落实为日常操作和每一张记录。