培养基怎么灭菌（除菌）？湿热、煮沸与过滤三种方式的参数与注意事项

培养基的灭菌方式，很多实验室是跟着 SOP 或者老同事的做法执行下来的。SOP 里写着 121 ℃、15 min，但为什么是这个数、哪些培养基不能用这个数，未必每个人都说得清。灭菌（除菌）这一步没做对，后面可能全白干。灭得不够，杂菌跟着进去，结果就是假阳性；灭过了头，糖焦了、指示剂褪了、pH 也超标了，目标菌要么不长，要么长得跟对照培养基上对不上，无奈再来一遍。

下面按三种最常用的方式展开：湿热灭菌、煮沸、过滤除菌，各自用在哪、参数怎么定、哪里最容易出错，法规依据是《中国药典》2025 年版和 GB 4789.28—2024。

一、三种方式，各管一段

先用一张表把三者的适用对象和主要风险摆在一起。

方式	原理	适用对象	主要风险
湿热灭菌（高压蒸汽）	饱和蒸汽使菌体蛋白质、核酸变性	大多数耐热培养基、器具、废弃物	过热破坏营养、糖焦化、pH 超标
煮沸（短时加热）	约 100 ℃ 加热，杀灭营养细胞并溶解琼脂	含热敏选择剂、指示剂，不宜高压的培养基	不能完全杀灭芽孢，不等于灭菌
过滤除菌（膜过滤）	0.22 μm 滤膜机械截留微生物	抗生素、血清、维生素、部分糖、酶等热敏成分	不能除病毒、毒素；破膜漏滤

简单说：耐热、又要求彻底无菌的，走湿热灭菌；含热敏选择剂或指示剂、经不起高压的，走煮沸；至于抗生素、血清这一类成分，不能让它们进灭菌锅，而是先让基础培养基灭好，再把过滤除菌后的成分无菌方式加进去。

二、湿热灭菌：主力，但不是越久越保险

湿热灭菌，是把物品放进灭菌设备内，用饱和蒸汽（或蒸汽-空气混合物）让菌体的蛋白质、核酸变性。它的效力同时来自温度、时间和湿热三个因素，是热力灭菌里最有效、应用最广的一种。《中国药典》2025 年版四部通则 1421 对它作了明确定义。

参数怎么定？通则 1421 给的答案并不是某个固定温度，而是"温度-时间参数"，或者结合 F0 值综合判断，并应证明所采用的灭菌工艺能确保物品灭菌后非无菌单元概率 PNSU 不高于 10⁻⁶（即通常所说的无菌保证水平 SAL 达到 10⁻⁶）。

F0 值，是把整个灭菌过程折算到 121 ℃ 下的等效灭菌时间（Z = 10 ℃）。工程上常把 F0 ≥ 8 min 作为可靠灭菌的参考线，过度杀灭法一般取 F0 ≥ 12 min。

但对培养基来说，"F0 越高越好"恰恰是错的。F0 高，对无菌性是加分，对热敏的营养物和选择剂却是减分。121 ℃ / 15 min 只是一个常见的起点参数，不是万能公式；真正合规的做法，是使用经过验证的灭菌程序。

哪些能用 121 ℃，哪些不能？

适合的：遇高温高湿性能稳定的物品，多数常规培养基、器具、废弃物都在此列。
需要降低强度或更换方式的，主要有几类：含糖或还原性物质的，高温易焦化、褐变（褐变主要为美拉德反应），营养会下降；含选择性染料或指示剂的，例如煌绿、结晶紫、中性红、亮绿、酚红，可能变色、失活；含热敏盐类的，比如 RV 沙门菌增菌液体培养基，药典规定灭菌温度不能超过 115 ℃；含蛋白质、血清、卵黄的，高温下会凝固、变性。

湿热灭菌里最容易出岔子的五个地方：

排尽冷空气。残留空气会破坏蒸汽的温压对应关系，是灭菌不彻底的常见原因之一。
控制装量。GB 4789.28—2024 要求培养基体积不超过容器容积的 2/3；体积超过 1000 mL 时，要用生物指示剂或相应设备验证灭菌效果。
时间别拖，灭完及时冷却。时间过长，氨基酸、糖类、维生素会分解，培养基变色、变质，甚至不凝固。
灭菌后确认 pH。GB 4789.28—2024 要求灭菌后 pH 落在标准值的 ±0.2 以内。
设备和程序都要验证。压力表定期检定，用生物指示剂或化学指示卡定期验证灭菌效果，对灭菌程序做确认。

常见的"降强度"做法

以下为行业常见做法（经验范围），不是规定；最终以厂家标准、药典及产品说明书为准。

培养基类型	常见参数（经验）	原因
含糖、热敏成分培养基	115 ℃ / 15～30 min，或糖类过滤除菌后无菌加入	防止焦化、褐变与营养破坏
RV 沙门菌增菌液体	≤ 115 ℃（市售常见 115 ℃ / 15～20 min）	药典设了上限（原因多与其中的氯化镁等热敏成分有关）
含煌绿等指示剂的培养基	降低温度或缩短时间，并快速冷却	防止染色剂降解、抑制能力下降

三、煮沸：它其实不算"灭菌"

这是最容易被混淆的一点。煮沸能杀死大部分营养细胞，但杀不灭细菌芽孢。所以严格讲，它不是"灭菌"，只是"溶解加短时加热"。GB 4789.28—2024 在这点上用词也很克制：它把这种方式称作"煮沸杀菌"，而不是"灭菌"，并要求培养基优先采用湿热灭菌或过滤除菌，只有确实无法使用这两种方式时，才退而改用煮沸处理。

下面几个典型培养基，药典的规定是这样的（《中国药典》2025 年版通则 1106）：

培养基	药典规定	能否用高压灭菌器
紫红胆盐葡萄糖琼脂（VRBGA）	加热煮沸	不能
木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂（XLD）	加热至沸腾，冷至 50 ℃ 倾注平皿	不能
肠道菌增菌液体培养基（EE）	加热至 100 ℃ 30 min，立即冷却	未禁止（见下文）

注：VRBGA 和 XLD 都是强选择性或鉴别培养基，里面有好几种热敏的染料和指示剂，药典直接写明"不能在高压灭菌器中加热"；EE 没有这条限制。

操作上还有两个细节值得说：

反复沸腾的代价。一直煮下去会暴沸溢出，水分也大量跑掉，培养基的浓度和配比就变了（琼脂相对变浓，凝固行为跟着变）。比较稳妥的做法是：一开始沸腾就离火，稍凉一点再加热到沸腾，这样来回几次，直到完全溶解、澄清透明、看不到琼脂颗粒。顺便说一句，这是经验做法，不是标准规定。
EE 的一个常见疑问。药典要求"加热至 100 ℃ 30 min"，可有些地方水浴就是稳不住 100 ℃，那能不能改用高压灭菌器设 100 ℃ / 30 min？药典并没有禁止用高压灭菌器加热 EE（明确写"不能"的只有 VRBGA 和 XLD）。实践中，在设备与程序经过验证、且加热后能立即冷却的前提下，这样操作是可以评估的。

四、过滤除菌：热敏成分只能走这条路

用 0.22 μm 的无菌滤膜，把溶液里的细菌、真菌拦下来。GB 4789.28—2024 写得很直接：过滤除菌就用 0.22 μm 孔径的无菌设备和滤膜。

哪些成分得走过滤除菌：

热敏成分	处理方式	注意
抗生素	过滤除菌后无菌加入	注意溶剂、浓度、避光，现用现配
血清、血液、卵黄	无菌原料或无菌采集	绝不能高压灭菌
维生素、辅酶	过滤除菌后加入	部分对光、氧敏感
酶类	过滤除菌	避免高温失活
显色底物	过滤除菌或按说明书后加	避光、低温保存
部分糖类	过滤除菌后加入	防止高温水解、焦化
还原剂、生长因子	按说明书处理	防止氧化失效

几个关键动作：

顺序不能反。先让基础培养基灭菌，冷却至 47 ℃~50 ℃（GB 4789.28—2024 3.4.3）后，再无菌加入已平衡至室温的除菌组分，避免琼脂凝结或形成片状物。
先做预过滤。料液浑浊、有颗粒或偏粘稠时，先用 0.45 μm 滤掉颗粒，再做 0.22 μm 除菌，不然滤膜很容易堵。
润洗滤膜。含蛋白质、抗生素这类容易被吸附的成分，过滤前可以用少量无菌水把滤膜润湿，减少吸附损失。
压力别给太猛。注射器推太快，或者抽滤负压太大，都可能把滤膜击穿、撕裂，除菌就白做了。
一液一膜，不重复使用。一次性滤器绝对不能再拿来用第二次。
过滤后尽快分装。按需要冷藏或冷冻，避免反复冻融。

过滤只能把微生物拦下，拦不住病毒，也去不掉细菌已经产生的毒素、内毒素。滤膜一旦破裂或漏液，就等于除菌失败，这批料液别再用了。

五、容易出错的地方

常见错误	严重度	正确做法
把煮沸溶解当成灭菌，直接用于计数或鉴定	高	煮沸不能杀芽孢；改用湿热灭菌，或按标准执行并做无菌性、性能验证
含糖、含煌绿、含氯化镁的培养基按常规 121 ℃ 处理	高	降低温度或缩短时间；或把糖、热敏成分过滤除菌后无菌加入
热敏成分和基础培养基一起高压灭菌	高	改为过滤除菌，基础培养基冷却后再无菌加入
一次性滤器重复使用；用 0.45 μm 代替 0.22 μm 做除菌	高	0.45 μm 只作预过滤；除菌一律用 0.22 μm，滤器一次性使用
培养基长时间 121 ℃ 过度灭菌	中高	按经验证的程序控制时间，及时冷却，防止褐变与 pH 漂移
装量过满，超过容器容积的 2/3	中	按 GB 4789.28—2024 分装，避免灭菌不均和暴沸外溢
灭菌后不做 pH 确认	中	冷却后测 pH，应落在标准值 ±0.2 以内，并记录
配制用水不达标	中	用符合 GB 4789.28—2024 的水：25 ℃ 电导率 ≤ 25 μS/cm，微生物 ≤ 10³ CFU/mL
熔化后反复加热，或重新凝固后再用	中	用沸水浴或等效方式熔化；熔化后 47～50 ℃ 保温、不超过 4 h，不得重新凝固再用

六、做完还得能证明：质控与记录

灭菌不是按下按钮就结束了。实验室要拿得出东西，证明这一批培养基是合格的。通常看三块：

培养基适用性检查（药典通则 1101、1105、1106 和 GB 4789.28—2024 附录）。这里含两块内容。一是无菌性检查，每批随机取一部分培养基，在规定温度下培养 14 天，应无细菌生长（通则 1101）。二是灵敏度（促生长）检查，按规定的质控菌株和回收率，看培养基能不能支持低菌量生长。
过程记录。培养基批号和配方、灭菌程序（温度、时间、F0）、灭菌后 pH、外观（颜色、透明度、凝胶状态）、分装量、无菌与性能结果，逐批留档，方便追溯。
程序验证。对灭菌程序做确认（装载方式、热分布、热穿透，必要时做微生物挑战试验），并定期用生物指示剂或化学指示卡复验。

写在最后

培养基的灭菌没什么特别的地方，说到底就是选对路线、控住参数、留下证据。别再把煮沸当成灭菌，也别抱着"多灭一会儿更放心"的想法。对热敏的培养基来说，多的那几分钟，可能恰恰是它失效的原因。